[发明专利]过氧合酶变体

说明书

序列表的引用

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背景

发明领城

本发明涉及过氧合酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法以及 使用这些变体的方法。

相关领域描述

WO2006/034702A1披露了使用茶树菇TMA1的AaP过氧合酶来酶促羟基化未活化 的烃(例如，萘、甲苯和环己烷)的方法。这也描述于乌尔里克(Ullrich)和霍夫里克特 (Hofrichter)，2005，欧洲生化学会联合会快报(FEBSLetters)579:6247-6250中。

DE10332065A1披露了用于通过使用茶树菇TMA1的AaP过氧合酶通过醛的中 间形成从醇中酶法制备酸的方法。

报道了用于通过该AaP过氧合酶而快速和选择性地以分光光度计直接检测芳香族 羟基化的方法(克卢格(Kluge)等人，2007，应用微生物学和生物技术(ApplMicrobiol Biotechnol)75:1473-1478)。

从嗜粪真菌辐毛鬼伞(Coprinusradians)中分离了另一种能够进行芳香族过氧 合化(peroxygenation)的过氧合酶并对其进行了表征，鉴定了N-末端16个氨基酸并与较早 公布的茶树菇的AaP酶的N-末端14个氨基酸进行了比对；但是未分离编码基因(安赫(Anh) 等人，2007，应用与环境微生物学(ApplEnvMicrobiol)73(17):5477-5485)。

WO2008/119780披露了若干种不同的过氧合酶多肽及其编码多核苷酸连同其重 组产生。

WO2011/120938披露了使用过氧合酶多肽的脂肪烃的位点特异性羟基化。

本发明提供了与其亲本相比具有改进的特性的过氧合酶变体。

发明概述

本发明涉及过氧合酶变体，这些过氧合酶变体在与SEQIDNO:2的成熟多肽的位 置E16、Y18、P28、P31、W38、R50、Y72、F92、M94、I98、T100、H102、C103、Y104、H107、L114、A144、 F146、M152、F163、Q167、Y180、T188、W195、M202、Y215、F216、S222、F224、F228、F229、M246、 F253、H256、Y258、Y281、Y287、F308、L317、T319、S345、F346、P347、G348、S349、和G350，优选 M94、A144、Y180、W195、Y215、F224、F228、和F229相对应的一个或多个(例如若干个)位置处 包括取代，其中这些变体具有过氧合酶活性。

本发明还涉及编码这些过氧合酶变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建 体、载体以及宿主细胞；以及产生这些变体的方法。

本发明还涉及使用过氧合酶变体的方法。

定义

过氧合酶：术语“过氧合酶”意指展现了根据EC1.11.2.1的“非特异性过氧合酶” 活性的酶，其催化来自H₂O₂的一个氧原子插入多种底物(例如硝基苯并二噁茂)中。出于本发 明的目的，过氧合酶活性是根据以下中描述的程序确定的：M.波拉杰-可比尔斯考(Poraj- Kobielska)，M.金尼(Kinne)，R.乌尔里克(Ullrich)，K.诗切布内尔(Scheibner)，M.霍夫里 克特(Hofrichter)，“用于检测真菌过氧合酶的分光光度计测定(Aspectrophotometric assayforthedetectionoffungalperoxygenases)”，分析生物化学(Analytical Biochemistry)(2012)，第421卷，第1期，第327-329页。

本发明的过氧合酶具有SEQIDNO:2的成熟多肽的至少20％、优选至少40％、更优 选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％、最 优选至少95％以及甚至最优选至少100％的过氧合酶活性。