[发明专利]具有增强的甲硫氨酸流出的用于甲硫氨酸生产的微生物

说明书

本发明涉及为了发酵生产甲硫氨酸和/或其衍生物而优化的重组大肠杆菌菌株，其中在所述重组菌株中，甲硫氨酸输入是减弱的，并且甲硫氨酸流出是增强的。它还涉及用于优化甲硫氨酸或其衍生物的发酵生产的方法，其包括下列步骤：a.在包含可发酵碳源和硫源的合适培养基中培养重组微生物，其中在所述微生物中，甲硫氨酸输入是减弱的，并且甲硫氨酸流出是增强的，和b.从培养基中回收甲硫氨酸和/或其衍生物。

发明领域

本发明涉及可用于生产L-甲硫氨酸和/或其衍生物的重组微生物和用于制备L-甲硫氨酸的方法。本发明的微生物以下述方式修饰，使得通过将L-甲硫氨酸摄取系统的减弱与特定的输出系统的过表达组合而提高甲硫氨酸/碳源得率。具体地，在重组微生物中，操纵子metNIQ是缺失的，并且基因ygaZ和ygaH或其同源基因是过表达。

背景技术

含硫化合物(如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸)对于细胞代谢是至关重要的。特别地，L-甲硫氨酸(一种必需氨基酸，其不能由动物合成)在许多身体功能中发挥重要的作用。产业生产的大部分甲硫氨酸广泛用作动物饲料和食物添加剂。

随着由于BSE和禽流感所致的动物来源蛋白质的使用减少，纯甲硫氨酸的需要已经增加。通常，D,L-甲硫氨酸自丙烯醛、甲基硫醇和氢氰酸化学合成。然而，外消旋混合物性能不像纯L-甲硫氨酸一样好(Saunderson,1985)。另外，虽然可以自外消旋甲硫氨酸生成纯L-甲硫氨酸，例如经由N-乙酰基-D,L-甲硫氨酸的酰基酶(acylase)处理，但是这明显增加生产成本。因而，与环境关切偶联在一起的纯L-甲硫氨酸的需要增加使甲硫氨酸的微生物生产成为一种有吸引力的预期。

其它重要的氨基酸(如赖氨酸、苏氨酸和色氨酸)经由发酵生产以在动物饲料中使用。因此，可以使用葡萄糖和其它可再生资源作为起始材料来生产这些氨基酸。经由发酵工业生产L-甲硫氨酸尚未获得成功，但是技术的开发在进行中。

先前已经描述了用于优化微生物中的L-甲硫氨酸生成的不同办法(见例如专利或专利申请US 7,790,424、US 7,611,873、WO 2002/10209、WO 2005/059093和WO 2006/008097)；然而，从微生物中产业生产L-甲硫氨酸需要进一步改善。

当L-甲硫氨酸以某个水平以上合成时，它经由反馈回路抑制其自身进一步生成，并且破坏细胞的生理学。因此，这些改善之一是通过在重组L-甲硫氨酸过度生成者中降低微生物的L-甲硫氨酸输入能力同时增强L-甲硫氨酸流出而降低L-甲硫氨酸在微生物中的积累以确保有效生成。

早期生物化学和动力学研究证明了大肠杆菌(Escherichia coli)中的甲硫氨酸摄取牵涉至少两种特定的转运蛋白：高亲和力MetD和低亲和力MetP转运系统(Jones&George,1999；Kadner,1974)。这两者都受到内部甲硫氨酸池大小调节，并且对于MetD，已经推断出MetJ介导的阻抑(Kadner,1975；Kadner&Winkler,1975)。MetD甲硫氨酸摄取系统表征为ABC转运蛋白。在2002年，Merlin等报告了基因abc、yaeC和yaeE构成(comprise)metD，即编码甲硫氨酸摄取系统的基因座。他们提出分别将abc、yaeE和yaeC重命名为metN、metI和metQ。

甲硫氨酸输出在大肠杆菌中由复合物YgaZH及在谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)中由同源复合物BrnFE介导(等,2005)。YgaZ是负责输出L-缬氨酸和L-甲硫氨酸的支链氨基酸输出蛋白(exporter)(LIV-E)家族的成员。YgaZ与YgaH(一种预测的内膜蛋白)形成复合物以在其水平会对细胞有毒性的条件下输出氨基酸。