[发明专利]免疫原性增强的多糖-蛋白质缀合物及其快速高产的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫原性增强的多糖-蛋白质缀合物以及获得所述多糖- 蛋白质缀合物的快速高产的缀合方法。更特别地，本发明提供了使用用于 产生增强免疫原性的优化多糖链长度来开发的多糖蛋白质缀合物疫苗。本 发明还涉及用于使多糖与载体蛋白质缀合的具有提高的产率和更高的免 疫原性的还原胺化快速方法。

背景技术

疫苗接种(免疫接种)是引发免疫应答的方式。疫苗接种的方法包括 向活的实体施用疫苗，这继而激活人体的自然免疫系统。疫苗包含小剂量 的抗原，其为减弱的病原体或死病原体(例如细菌或病毒或病原体结构的 一部分)的制备物，其在施用后刺激抗体产生或针对病原体的细胞免疫。

在免疫学上，可将抗原分类为T细胞依赖性(TD)抗原或T-细胞非 依赖性(TI)抗原。蛋白质和肽通常是TD抗原并且需要来自辅助T淋巴 细胞的刺激以便引发免疫应答，并且由于记忆B和T淋巴细胞的形成而 诱导持久的免疫应答。与此相反，TI抗原刺激B细胞增殖和分化成分泌 抗体的效应细胞，无需T细胞的帮助并且不形成记忆B和T淋巴细胞。 大多数这些T细胞依赖性抗原是刺激产生低亲和力抗体的微生物多糖。

在革兰氏阴性菌中，在细菌荚膜中存在的多糖是显示出差的免疫原性 的重要毒力因子。缀合物疫苗是微生物多糖(polysaccharide，PS)抗原 与载体蛋白质(carrierprotein，CP)偶联的产物，从而将T细胞非依赖 性免疫应答转变成T细胞依赖性免疫应答。使用缀合物疫苗来免疫婴儿 和儿童以抵抗包含荚膜多糖的细菌引起的侵入性疾病。抗原性荚膜多糖与 载体蛋白质的偶联产生高度免疫原性的缀合物。

碳水化合物-蛋白质缀合物在基础研究中被广泛使用并且作为多种细 菌疫苗中的免疫原。已经付出了巨大的努力来开发用于构建这些缀合物的 简单且可靠的方法。虽然通过还原胺化进行直接偶联是有有吸引力的方 法，但其同样具有许多缺点。通过还原胺化的现有缀合方法是耗时且低产 率的方法，同时如此得到的缀合物显示出较低的免疫原性。

多糖-蛋白质缀合物的免疫学性能是长度依赖的，可能需要优化多个 表位也是一个公认的事实(Costantino等，1999)。还已知较小多糖片段 的选择性末端基团活化方法以一致的再现性产生了很好地限定了缀合物 疫苗。较大尺寸的多糖分子可具有空间上隐藏的表位，然而较小的片段在 缀合后将具有暴露于免疫系统的最大表位。

已经开发了用于制备较小的多糖片段的数种方法，包括多糖的解聚。 在现有技术中已充分地描述了多糖的解聚。例如，Laferriere等，2011年 的文章“ExperimentaldesigntooptimizeanHaemophilusinfluenzaetype bconjugatevaccinemadewithhydrazide-derivatizedtetanustoxoid”对 其进行了详细的描述。一个主要的缺点是该方法花费很长的时间(32小 时以上)，并具有约15％的缀合物产率。Anderson等，1986年也描述了 使用较小尺寸的多糖用于与白喉类毒素缀合，并发现由20个重复单元的 Hib-PRP制成的缀合物比由8个重复单元制成的那些具有更强的免疫原 性。他们的方法也花费很长的时间，即超过5天。

本发明通过提供用于使多糖与载体蛋白质缀合的具有提高的产率和 更高的免疫原性的还原胺化的快速方法克服了现有技术的缺点。本发明的 方法需要较短的缀合时间。本发明还提供了通过向免疫系统更好地暴露抗 原表位的免疫原性增强的小尺寸多糖。

发明目的

因此，本发明的主要目的是提供免疫原性增强的多糖-蛋白质缀合物。

本发明的另一个目的是提供用于多糖片段化的化学方法。

本发明的另一个目的是提供用于流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)b型(Hib)的免疫原性增强的较低分子量(LowerMolecular Weight，LMW)多糖蛋白质缀合物疫苗。

本发明的另一个目的是提供用于脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)血清组A和C(MenA和MenC)的免疫原性增强的较高分 子量(HigherMolecularWeight，HMW)多糖蛋白质缀合物疫苗。