[发明专利]核酸酶概况分析系统

说明书

本公开的一些方面提供了用于确定核酸酶靶位点偏好性和位点特异性内切核酸酶的特异性的策略、方法和试剂。本文中提供的一些方法利用了新的“单切割”策略来筛选包含候选核酸酶靶位点和恒定插入区的重复单元的多联体文库，经由对临近和等同于切割靶位点的完整靶位点测序，从而鉴定出可由感兴趣的核酸酶切割的文库成员。本公开的一些方面提供了基于测定位点特异性内切核酸酶的靶位点偏好性和特异性，用于选择位点特异性内切核酸酶的策略、方法和试剂。还提供了用于测定靶位点偏好性和特异性的方法和试剂。

相关申请

本申请要求35U.S.C.§365(c)下对2014年6月30日提交的美国申请U.S.S.N 14/320,370和2014年6月30日提交的美国申请U.S.S.N 14/320,413的优先权，而且还要求35U.S.C.§119(e)下对2013年8月9日提交的美国临时专利申请U.S.S.N.61/864,289的优先权，其各自通过提述并入本文。

政府支持

在美国政府支持下，本发明在国防高等研究计划署(Defense Advanced ResearchProjects Agency)资助的项目号HR0011-11-2-0003和N66001-12-C-4207下进行。美国政府对本发明具有某些权利。

发明背景

位点特异性内切核酸酶理论上允许靶向性操作基因组内的单个位点且可用于基因靶向以及治疗应用的背景中。在包括哺乳动物在内的多种生物体中，位点特异性内切核酸酶被用于基因组工程，其通过刺激非同源末端连接或同源重组进行。除了提供强大的研究工具以外，位点特异性核酸酶还具有作为基因治疗剂的潜力，而且最近两种位点特异性内切核酸酶进入临床试验：一种是CCR5-2246，其靶向人CCR-5等位基因，作为抗HIV治疗性办法的一部分(NCT00842634,NCT01044654,NCT01252641)，另一种是VF24684，其靶向人VEGF-A启动子，作为抗癌症治疗性办法的一部分(NCT01082926)。

对意图的核酸酶靶位点进行特异性切割而没有或仅有最小的脱靶活性是临床应用位点特异性内切核酸酶和基础研究应用中高效基因组操作的前提，因为工程化的位点特异性结合域的不完美的特异性与细胞毒性和意图靶物以外的基因组基因座的不想要的改变关联。然而，当前可获的大多数核酸酶展现出显著的脱靶活性，如此可能不适用于临床应用。因此，需要用于评估核酸酶特异性和以改进的特异性工程化核酸酶的技术。

发明概述

本公开的一些方面基于以下认知，即一些工程化的位点特异性内切核酸酶的报道的毒性基于脱靶DNA切割而不仅仅是脱靶结合。本公开的一些方面提供了评估和表征位点特异性核酸酶的序列特异性的策略、组合物、系统和方法，例如可RNA编程的(RNAprogrammable)内切核酸酶，如Cas9内切核酸酶、锌指核酸酶(ZNF)、归巢内切核酸酶、或转录激活物样元件核酸酶(TALEN)。