[发明专利]用于在胱天蛋白酶抑制剂存在下无细胞蛋白合成的方法和装置

说明书

技术领域

本发明涉及在胱天蛋白酶抑制剂的存在下使用真核细胞裂解物进行无 细胞蛋白合成的改进的方法、用于进行此方法的装置、以及在此种使用真 核细胞裂解物合成蛋白的无细胞方法中胱天蛋白酶抑制剂用于提高所合成 蛋白的产率和/或稳定性的用途。

背景技术

近来，无细胞蛋白合成已经成为体内蛋白表达的有效替代(Carlson，E.D. etal.，BiotechnologyAdvances，2012，30(5):pp.1185-1194)。在本文中， 使用细胞内含物以便以快速、可靠以及有成本效益的方式来制造特定的目 标蛋白。所获得的细胞提取物也称作细胞裂解物，含有无细胞蛋白合成所 需的基本成分：核糖体、翻译因子和酶。如今，可以在原核细胞以及真核 细胞裂解物中以有功能活性的形式制造选定的重组蛋白。目前，如下基于 真核细胞裂解物的翻译系统的使用日益增多：麦胚裂解物、网状细胞裂解 物、昆虫细胞裂解物、以及来自HeLa和HeLa杂交瘤细胞的细胞提取物。

与基于大肠杆菌(Escherichiacoli)的原核体外翻译系统相比，使用大部 分真核翻译系统的蛋白产率相对较低(上文的Carlsonetal.)。这一方面的例 外是极其有效的麦胚裂解物表达系统。基于蛋白和反应形式，其实现了每 毫升反应体积几百微克蛋白(Madin，K.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 2000.97(2):pp.559-64)。然而，此细胞提取物不适宜用于合成具有翻译后 修饰(例如糖基化)的蛋白。

基于昆虫细胞裂解物和网状细胞裂解物的真核翻译系统使得可以合成 具有翻译后修饰的复杂结构的蛋白(其不能在大肠杆菌中合成)。然而，网状 细胞裂解物必需为此目的而用另一物种的微粒体膜进行富集化(非均质翻 译系统)。与之相反，来自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)的细胞裂解物 可以用作均质翻译系统，这是由于所述细胞裂解物与所含有的膜小泡源自 相同的细胞系。通过适宜的细胞分解方法的措施，可以获得含有重要的细 胞区室(具体而言内质网)成分的真核细胞裂解物。从细胞排出的或者掺入细 胞膜内的所有蛋白，携带有糖残基或者具有二硫桥用于稳定其分子结构， 迁移穿过此细胞区室。含有ER结构(所谓的微粒体或膜小泡)的细胞裂解物， 现在可以用于制造具有功能活性形式的此类蛋白候选。以此方式，防止了 裂解物的小泡和细胞质蛋白之间的不匹配性，结果是相对较高的蛋白产率 (在分批模式的昆虫细胞裂解物中达到20μg/ml)以及目标蛋白有效转移至 裂解物的微粒体内。

无细胞蛋白合成反应在实验上可以通过各种方式来实现。最简单的反 应路径是在一锅反应(分批反应)中合成目标蛋白。基于分批的系统因而适宜 用于目标蛋白不复杂且快速的合成。然而另一方面，其特征是短的运行时 间以及相对较低的蛋白产率。

一般而言，基于分批的无细胞翻译反应在1-1.5小时后达到所合成目标 蛋白的最大值。超过此时间的温育时间并不会导致蛋白产率增加，而很大 可能会导致目标蛋白浓度的降低，这可能是由于目标蛋白的蛋白水解分解， 例如由细胞提取物中存在的蛋白酶所分解。然而，在特定的情况下高度有 利的是，还将所合成的目标蛋白以完整的形式保存在翻译溶液中更长的温 育时间(>2h)。

延长无细胞蛋白合成反应的运行时间以便由此获得更高的蛋白产率的 一种可能是，使用透析系统(持续交换无细胞系统，CECF；Spirin,A.etal.， Science，1988，242(4882):pp.1162-4)。在本文中，高能物质如ATP和GTP 通过扩散穿过膜进入反应区室内(进行翻译的处所)。同时，反应耗尽了抑制 性物质如游离的磷酸盐和ADP。

在反应区室中连续供应无细胞反应延长了合成的运行时间，并且导致 与分批系统相比显著提高的蛋白产率。此类型的透析系统已经是商业可购 买的，虽然只会与原核细胞裂解物(来自大肠杆菌)或者与麦胚裂解物组合提 供。

尽管与不连续的分批系统相比产率提升，但是使用相应真核透析系统 的蛋白产率与基于大肠杆菌的系统相比依然相对较低。

针对此背景，本发明的目的是提供这样的措施，其使得能够在无细胞 翻译系统中，以相对较大的量合成稳定且有功能活性形式的复杂真核和原 核蛋白，特别是膜蛋白或者具有翻译后修饰的蛋白。