[发明专利]O-甘露糖基转移酶缺陷的丝状真菌细胞及其使用方法

权利要求书

1.PMT缺陷的丝状真菌细胞，包含：

a)第一突变，其与不具有所述第一突变的亲本丝状真菌细胞相比降低或消除内源蛋白 酶活性，和

b)在PMT基因中的第二突变，其与不具有所述第二突变的亲本丝状真菌细胞相比降低 内源O-甘露糖基转移酶活性，

其中所述丝状真菌细胞选自木霉属、链孢霉属、毁丝霉属和金孢霉属细胞。

2.权利要求1所述的PMT缺陷的丝状真菌细胞，其中所述降低内源O-甘露糖基转移酶活 性的第二突变是编码内源蛋白O-甘露糖基转移酶活性的PMT基因的缺失或破坏。

3.权利要求1或2所述的PMT缺陷的丝状真菌细胞，其中所述PMT基因中的第二突变是在 以下中的突变：

a)包含SEQIDNO：1的多核苷酸的PMT1基因，

b)PMT1基因的功能性同源基因，所述功能性同源基因在引入具有所述PMT1基因中的破 坏的里氏木霉菌株时能够通过功能性互补恢复亲本的O-甘露糖基化水平，或

c)编码与SEQIDNO：2具有至少50％同一性的多肽的多核苷酸，所述多肽具有O-甘露 糖基转移酶活性。

4.权利要求1-3任一项所述的PMT缺陷的丝状真菌细胞，其中所述细胞具有第三突变， 其与不具有所述第三突变的亲本细胞中的表达水平相比降低或消除ALG3基因的表达水平。

5.权利要求4所述的PMT缺陷的丝状真菌细胞，进一步包含编码N-乙酰葡糖胺基转移酶 I催化结构域的第一多核苷酸和编码N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的第二多核苷 酸。

6.权利要求1-5任一项所述的PMT缺陷的丝状真菌细胞，进一步包含一个或多个编码选 自以下的多肽的多核苷酸：

a)α1,2甘露糖苷酶；

b)N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域；

c)α甘露糖苷酶II；

d)N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域；

e)β1,4半乳糖基转移酶；和

f)岩藻糖基转移酶。

7.权利要求1-6任一项所述的PMT缺陷的丝状真菌细胞，其中所述细胞是包含降低或消 除木霉属pmt1的蛋白O-甘露糖基转移酶活性的木霉属细胞。

8.权利要求1-7任一项所述的PMT缺陷的丝状真菌细胞，其中所述细胞是木霉属细胞， 例如里氏木霉，且所述细胞包含降低或消除以下活性的突变：

a)三种内源蛋白酶pep1、tsp1和slp1，

b)三种内源蛋白酶gap1、slp1和pep1，

c)选自以下的三种内源蛋白酶：pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8,、pepl1、pepl2、 tsp1、slp1、slp2、slp3、slp7、gap1和gap2，

d)选自以下的三至六种蛋白酶：pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、tsp1、slp1、slp2、slp3、 gap1和gap2，或

e)选自以下的七至十种蛋白酶：pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep7、pep8、tsp1、slp1、 slp2、slp3、slp5、slp6、slp7、slp8、tpp1、gap1和gap2。

9.用于生产具有降低的O-甘露糖基化的蛋白质的方法，包括：

a)提供PMT缺陷的丝状真菌细胞，其在PMT基因中具有突变并进一步包含编码具有丝氨 酸或苏氨酸残基的蛋白的多核苷酸，所述突变与不具有所述突变的亲本菌株相比降低内源 O-甘露糖基转移酶的活性，

b)培养所述PMT缺陷的丝状真菌细胞以生产所述具有降低的O-甘露糖基化的蛋白，

其中所述丝状真菌细胞选自木霉属、链孢霉属、毁丝霉属或金孢霉属细胞。