[发明专利]重组微生物和其使用方法

说明书

本发明提供用于制备重组梭菌属的选择标记、方法、核酸和载体。

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年9月12日提交的临时申请号61/877,272的优先权，该临时申请的内容特此以引用的方式并入。

技术领域

本发明涉及用于制备重组梭菌属(Clostridium spp)的选择标记。

背景技术

用于制造重组生物体的方法是已知的。所述方法通常包括用外源核酸载体转化生物体，所述外源核酸载体可与宿主基因组整合或保持在稳定的独立(例如，染色体外)状态。

将外源核酸整合至宿主基因组中涉及载体与内源核酸之间的双交叉事件。双交叉重组在过低的频率下发生以致于不能仅靠偶然来可靠地鉴定整合体。因此，选择一个或两个交叉的方法在时间和劳力上都对鉴定频率具有巨大益处。

用于筛选重组事件的选择标记是已知的。这些标记通常是赋予宿主生物体以选择性优点(正向选择)或缺点(反向选择)的蛋白质编码序列。多种正向选择和反向选择标记是已知的并且可以用于筛选其中已发生所希望的重组事件的生物体。正向选择标记通常包含当表达时允许生物体在特定生长环境中存活的基因。反向选择标记通常包含当表达时产生对生物体致命的毒素的基因。

在除梭菌之外的细菌中，存在过多的可用反向选择标记，但不幸的是由于生理或遗传原因，绝大多数在梭菌中不起作用。

本发明的一个目的是克服现有技术的一个或多个缺点，或至少向公众提供有用的选择。

发明内容

在第一方面，本发明提供ThiK和/或PheS在从亲本微生物产生重组微生物的方法中作为反向选择标记的用途，其中所述亲本微生物是梭菌属，并且其中所述PheS相比于野生型PheS包括至少一个变异以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA。

在第二方面，本发明提供编码ThiK和/或PheS的核酸在用于从亲本微生物产生重组微生物的质粒中的用途，其中所述亲本微生物是梭菌属，并且其中所述PheS相比于野生型PheS包括至少一个变异以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA。

在第三方面，本发明提供包含编码ThiK和/或PheS的核酸的质粒用于从亲本微生物产生重组微生物的用途，其中所述亲本微生物是梭菌属，并且其中所述PheS相比于野生型PheS包括至少一个变异以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA。

在第四方面，本发明提供用于从亲本微生物产生重组微生物的方法，所述方法包括至少如下步骤：

a)用质粒转化亲本微生物，所述质粒包含：

1.编码选自PheS和ThiK的至少一个反向选择标记的至少一个核酸序列，其中所述PheS相比于野生型PheS包括至少一个变异以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA；

2.编码至少一个正向选择标记的至少一个核酸序列；和

3.与所述亲本微生物的基因组内的目标位置周围的所选区域同源的两个核酸序列，其允许所述质粒与所述亲本微生物的基因组重组；

b)选择表达所述至少一个正向选择标记的一种或多种微生物；和

c)选择不表达所述至少一个反向选择标记的一种或多种微生物。

在一个实施方案中，选择步骤b)和c)是同时进行的。在另一个实施方案中，选择步骤b)和c)是依序进行的。

在一个实施方案中，所述质粒还包含有待插入亲本基因组中的至少一个所关注核酸序列。