[发明专利]鉴定细胞群体、特别是间充质干细胞群体的多色流式细胞术方法

说明书

技术领域

本发明属于借助于差示特异性荧光活化细胞分选(FACS)对间充质干细胞(MSC)和其它细胞类型的进行鉴定并进而进行分离的领域。即，本发明是处于各种相对特定浓度的试剂或物质组合物，所述试剂或物质组合物由于试剂中的标记的细胞标志物的各种特定浓度而令人意外地对标记的细胞提供了医学(或生理学)效应。本发明是用于借助于特定的相对试剂浓度对细胞进行选择性分离的试剂和方法。本发明人提供了一种令人意外的手段，通过这种手段，可以使物质组合物作为药物区别地作用于细胞上，从而使得能够利用荧光活化细胞分选(FACS)在七种以上细胞表面标志物存在或不存在时对细胞进行同时鉴定。

背景技术

间充质干细胞(MSC)由于其在再生医学领域的潜力而受到巨大关注，且被用于针对多种病症的临床试验中。MSC已在患急性心肌梗死[1,2]、脑卒中[3]、多系统萎缩(MSA)[4]、移植物抗宿主疾病[5]和脊髓损伤[6]的患者中显示出治疗益处的潜力。国际细胞疗法协会(ISCT)建立了一套用于鉴定MSC的最低标准[7]。这些标准是：i)对塑料的粘附性，ii)分化为脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞，和iii)细胞表面分子的特定表达模式。前两个标准在不同条件下的细胞培养物中进行评估，而第三个标准可以利用多色流式细胞术(MFC)来评估。为了被鉴定为MSC，细胞群体中大于95％必须表达CD73(外5’-核苷酸酶)、CD90(Thy-1)和CD105(内皮因子)，并且对于CD11b或CD14、CD34、CD45、CD19或CD79α和HLA-DR为阴性(≤2％阳性细胞)[7]。

传统上一直使用平行管法对MSC的表面标志物模式进行分析：多个样品管，每管具有两至四种抗体的组合，所述抗体各自缀合至不同的荧光团。这具有实践上的限制。例如，在假设细胞群体是均质的前提下对来自这些平行管的结果进行分析，并报告表面标志物的百分比表达。

迄今为止所公布的针对MSC的多色试剂组的实例忽视了所推荐的细胞标志物的ISCT标准(Martins等，2009；Jones等，2006)、利用平行管而不是单管法(Tucker和Bunnell,2011)或者利用定制的缀合物和最常见的荧光色素(Bradford和Clarke,2011)从而产生一种不灵活的无法适用于个体研究要求的工具。在某些情形中，研究人员并没有确认被流式细胞术鉴定为MSC的细胞也符合另外两条最低标准：对塑料的粘附性和三系分化能力(Martins等，2009)。

发明内容

本发明人出人意料地开发了一种多色流式细胞术(MFC)试剂组(panel)，其包括ISCT推荐的在塑料粘附性细胞上的间充质干细胞MSC标志物，所述塑料粘附性细胞已证实能分化为脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞。本发明人已设计了一种核心试剂组，其不采用与三种最常用的荧光色素缀合物(即FITC(异硫氰酸荧光素)、PE(藻红蛋白)和APC(别藻蓝蛋白))缀合的试剂，从而使得上述三个位置能被用作可交换的占位位置(placeholder)，并允许将所述核心试剂组与其它所关注的抗原结合使用。本发明人已经验证了利用来自两种常用组织来源(即脐带基质和BM抽吸物)的MSC的试剂组。本发明人还确保了所述试剂组可以用于鉴定非均质群体中的MSC。

多色流式细胞术(MFC)与单色流式细胞术不同，其在检测试验的开发中带来了更高的技术难度。为了同时分析几种表面标志物，每种表面标志物需要特定的检测用抗体。在流式细胞术中，最好是使用与荧光色素直接缀合的抗体，而不是使用用于检测的一抗和用于信号放大的二抗。因此，当同时使用多种抗体时，必须明智地选取与其缀合的荧光色素从而使它们不会在其发射波长上重叠。简而言之，应该选择在彩色光谱中尽可能相互远离的荧光色素。成功主要取决于三个因素：最佳滴定的抗体，准确的补偿，和抗原-荧光色素平衡。下文将更详细地讨论如何将此实现。

本发明的方法相比平行管法具有几个优点。首先，对于在临床设定中对患者样品或治疗性细胞产品中的特定细胞类型进行准确定量而言，关键在于在单细胞水平鉴定细胞表型的准确性的提高。这也会带来提高的检测灵敏度，使得能够利用成熟的分析策略在混合细胞样品中鉴定出MSC。这在研究可能是非均质的临床样品时尤为优越。其次，单管流式细胞术使得能从例如活组织检查物或儿科样本等小样品中获得最大化的信息，并且其还有助于更大的研究项目，因为对每个研究对象仅需一个试管。最后，多色法有助于检测不同类型的MSC，并允许同时分析表型和功能性，例如细胞因子生成、凋亡和细胞周期分析(DeRosa等，2003)。