[发明专利]突变的免疫球蛋白结合多肽

说明书

本发明公开了碱性稳定性改进的多肽，所述多肽包含由SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2指定的葡萄球菌A蛋白(SpA)的B或C结构域或由SEQ ID NO 3指定的Z蛋白的突变体，其中至少9位的谷氨酰胺残基突变成天冬酰胺以外的氨基酸。本发明还公开了所述多肽的多聚体以及包含所述多聚体或多肽的分离基质。

发明的技术领域

本发明涉及亲和层析领域，更具体地说涉及A蛋白的突变的免疫球蛋白结合结构域，其可用于免疫球蛋白的亲和层析法。本发明还涉及突变结构域的多聚体和含有突变结构域或多聚体的分离基质。

发明背景

免疫球蛋白代表着全球制造和研发中最流行的生物制药产品。对这个特殊治疗市场的高度商业需求和由此带来的价值导致重点放在制药公司上，以最大化其相应mAb生产过程的生产率，同时控制相关成本。

在大多数情况下使用亲和层析法作为这些免疫球蛋白分子(例如单克隆或多克隆抗体)纯化中的关键步骤之一。一类特别令人感兴趣的亲和试剂是能够与免疫球蛋白分子的不可变部分特异性结合的蛋白质，所述相互作用不依赖于抗体的抗原结合特异性。所述试剂可广泛用于从不同样品中亲和层析法回收免疫球蛋白，所述样品例如但不限于血清或血浆制品或细胞培养物来源的原料。所述蛋白质的一个实例是葡萄球菌A蛋白，其含有能够与来自不同物种的IgG免疫球蛋白的Fc和Fab部分结合的结构域。

基于葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal protein A，SpA)的试剂由于其高亲和力和选择性，广泛应用于生物技术领域，例如用于检测或量化，以及用于抗体的俘获和纯化的亲和层析法。目前，对于来自包括工业细胞培养上清液在内的不同样品的单克隆抗体及其片段的分离，基于SpA的亲和介质可能是最广泛使用的亲和介质。因此，包含A蛋白-配体的各种基质是市购可获得的，例如，呈天然A蛋白的形式(例如A蛋白SEPHAROSE™，GEHealthcare，Uppsala，Sweden)，还包括重组A蛋白(例如rProtein A-SEPHAROSE™，GEHealthcare)。更具体地说，在市售重组A蛋白产品中进行遗传操作的目的在于促进其与支持物连接。

这些应用，像其它亲和层析法应用一样，需要全面注意明确除去污染物。所述污染物可例如为在层析分析程序中吸附于固定相或基质上的非洗脱分子，例如不需要的生物分子或微生物，包括例如蛋白质、碳水化合物、脂质、细菌和病毒。从基质中除去所述污染物通常在所需产物的第一次洗脱之后进行，以在后续使用之前使基质再生。所述除去通常包括称为就地清洗(cleaning-in-place，CIP)的程序，其中使用能够从固定相中洗脱污染物的剂。常用的这样一类剂是通过所述固定相的碱性溶液。目前最广泛使用的清洁剂和消毒剂是NaOH，其浓度的范围可为0.1直到例如1 M，这取决于污染的程度和性质。该策略与将基质暴露于超过13的pH值有关。对于许多含有蛋白质性亲和配体的亲和层析基质，所述碱性环境是非常严酷的条件，并由于配体对所涉及的高pH的不稳定性，因此导致能力降低。

因此大量研究集中在开发显示耐受碱性pH值的能力改进的工程改造的蛋白质配体。例如，Gülich等人(Susanne Gülich, Martin Linhult, Per-Åke Nygren, MathiasUhlén, Sophia Hober, Journal of Biotechnology 80 (2000), 169-178)提出经工程改造以改进链球菌白蛋白结合结构域(ABD)在碱性环境中的稳定性质的蛋白质。Gülich等人制备了ABD的突变体，其中所有4个天冬酰胺残基被亮氨酸(1个残基)、天冬氨酸(2个残基)和赖氨酸(1个残基)置换。此外，Gülich等人报告了他们的突变体显示类似于天然蛋白的靶蛋白结合性质，且在重复暴露于碱性条件后，含有经工程改造的配体的亲和柱显示与使用亲代未工程改造的配体制备的柱相比较高的结合能力。因此，本文得出结论，所有4个天冬酰胺残基可被置换而对结构和功能无任何显著作用。