[发明专利]芽孢杆菌种的生物质和代谢物的生产方法及其用于生物害虫防治的组合物

说明书

技术领域

本发明涉及一种增加包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的芽孢杆菌种的生物质和代谢物的生产的方法。该方法包括适宜的培养基和特定的环境条件，使得能够生产大量的丰原素、表面活性肽和伊枯草菌素家族的生物质和代谢物，其表现出对各种植物致病剂的抗真菌及抗细菌活性。

背景技术

在用于生物防治的微生物中，芽孢杆菌种属的细菌受到广泛关注，因为它们能产生多种多样的抗生素化合物、保存期限长、培养时生长迅速、以及它们能够在叶面大量繁殖[1,2,3,4]。尤其是，特定种类的芽孢杆菌例如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、蕈状芽胞杆菌(Bacillusmycoides)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)及苏云金芽孢杆菌(Bacillusthurigiensis)显示出抗微生物活性[4]。

这些细菌的抗微生物活性源于它们产生表面活性肽、伊枯草菌素和丰原素家族的脂肽的能力，这些脂肽的氨基酸序列及脂肪酸链的分支不同。表面活性肽表现出高的抗细菌活性，而伊枯草菌素和丰原素则因其抗真菌活性为人所知[4]。

现有技术描述了使用枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌在多种作物中控制各种致病微生物，上述作物包括水果和蔬菜作物例如黑莓、葡萄、覆盆子、草莓、西红柿、黄瓜、黑胡椒、橙、哈密瓜、苹果、桃、番荔枝、香蕉、木瓜、芒果和猕猴桃。

EP2311936公开了一种枯草芽孢杆菌菌株KS1(NITEBP-569)作为生物控制剂在藤木植物中抵抗几种植物病原微生物。WO98/21968公开了枯草芽孢杆菌AQ153(ATCC55614)产生的一种抗生素，其能有效对抗细菌和真菌感染，并且也可以作为用于保护植物的方法，其包含这些抗生素化合物的应用。

WO9850422和WO0029426公开了枯草芽孢杆菌菌株AQ713(NRRLB21661)及其突变体产生的其它抗生素化合物，其显示出杀虫、抗真菌和抗细菌活性。WO9909819公开了枯草芽孢杆菌菌株AQ713(NRRLNo.21665)的抗生素，其产生具有杀虫活性的代谢物及一种高分子量的可溶于水的代谢物，其显示出对抗玉米根虫和其它线虫的杀虫及杀线虫活性。

US2011/0318386描述了通过使用芽孢杆菌属的生物控制剂诱导针对各种病原体的系统抗性，特别是分离的摩加夫芽孢杆菌(B.mojavensis)203-7和分离的蕈状芽胞杆菌。接着ES2345969描述了一种用于香蕉和大蕉假茎(plantainpseudostems)的植物强化剂(phytostrengthener)，其包括枯草芽孢杆菌、绿色木霉菌(Trichodermaviride)和巨大芽孢杆菌解磷变种(B.megateriumvarphosphaticum)。

US2012/00031999公开了一种针对各种真菌病害，包括香蕉的黑叶斑病的控制策略，基于应用合成的杀真菌剂和一些生物控制微生物及其代谢物(特别是枯草芽孢杆菌菌株QST713，对应于商用产品的菌株)。

现有技术中公开的芽孢杆菌种的微生物的生产过程中，其生产的生物质的量非常低，因为所获得的细胞密度一般不大于5.0克/升[8,9]。因此，有必要开发新的方法以增加生物质及其活性代谢物的产量。

类似的，有必要从这些微生物和/或其生物活性代谢物中开发出具有更高效力和选择性的生物杀伤组合物，用于在各类作物上控制不同的植物致病剂。

附图说明

图1示出了枯草芽孢杆菌EA-CB0015生产的丰原素C的结构。

图2示出了枯草芽孢杆菌EA-CB0015在不同培养基中的细胞密度。

图3示出了枯草芽孢杆菌EA-CB0015的化合物的HPLC色谱图。

图4示出了枯草芽孢杆菌EA-CB0015的P5纯化的脂肽(m/z1429.9)的MS/MS图谱。

图5示出了枯草芽孢杆菌EA-CB0015的内酯环经碱水解后，P5纯化的脂肽(m/z1447.8)的MS/MS图谱。

图6示出了枯草芽孢杆菌EA-CB0015在各种培养基中生产的脂肽的曲线下面积。

图7示出了枯草芽孢杆菌EA-CB0015对各种植物病原性微生物产生的抑制百分比。

图8示出了在不同培养基中获得的枯草芽孢杆菌EA-CB0015CFS所产生的斐济球腔菌(Mycosphaerellafijiensis)的生长抑制百分比。