[发明专利]使用合成信使RNA无饲养层衍生人诱导多能干细胞

说明书

相关申请

本申请要求2013年5月13日提交的美国申请序列号13/893,166 的权利并是它的部分连续案；该申请要求2012年5月13日提交的美 国临时申请序列号61/646,292的优先权的权利。这些申请的每一个的 内容在此以其整体引为参考。

技术领域

本公开主要涉及用于通过受控方法使用一种或多种工程化的重编 程因子来生成诱导多能干细胞(iPSC)的新方法和组合物。具体地， 本公开涉及建立重编程因子的组合，所述组合包括常规重编程因子与 反式激活结构域间的融合，其经优化用于多种细胞类型的重编程。更 具体地，本文所公开的示例性方法可用于从多种哺乳动物细胞类型， 包括非人的灵长类动物细胞产生诱导多能干细胞。还公开了使用合成 的信使RNA，无饲养层衍生人诱导多能干细胞的示例性方法。

背景技术

以下包括了可能有助于理解本公开各个方面和实施方式的信息。 这并非承认任何此处所提供的信息是现有技术，或与本文描述或要求 保护的发明相关，或者任何明确或隐含引用的出版物或文件是现有技 术。

诱导多能干细胞(iPSC)的治疗潜能激发了开发重编程方法的努 力，来回避对体细胞进行基因修饰以实现重编程进入多能状态的需求。 第一批在这方面成功实现的“非整合”方式——蛋白转导，质粒转染 和利用腺病毒载体——由于得到的iPSC的转化率低而在应用中受到限 制。最近已证明，采用游离型DNA、仙台病毒、和合成的信使RNA (mRNA)的技术产生的“无足迹”iPSC，得到的效率相当于或超过使 用整合病毒载体得到的效率。RNA转染原则上是这些方法中最有吸引 力的，因为它提供对重编程因子(RF)表达时间过程的精确控制，而 完全避免了对于“清理”被重编程的细胞以清除载体的残余痕迹的任 何要求。然而，由于为诱导人细胞中的多能性而要求每日重新转染持 续约2周的这一需求，目前基于mRNA的重编程流程相对劳动强度较 大。这些过程还依赖于使用饲养层细胞，这增加了过程的复杂性和技 术上的可变性，同时引入了非人源的(“异种”)的生物材料的潜在 污染源。

生成诱导多能干细胞(iPSC)的主要困难是将分化细胞重编程为 多能细胞的效率低。先前已经报道，当用由Oct4和MyoD的反式激活 结构域(称为M3O)组成的融合基因，连同Sox2，Klf4和c-Myc(SKM) 转导的时候，5％的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)被重编程成iPSC。此 外，在大多数转导的MEF中，包括没有成为iPSC的细胞中，M3O促 进多能性基因的染色质重塑。这些观察表明了在给予更有利的培养条 件下超过5％的细胞获得成为iPSC的能力的可能性。

发明内容

由于RNA分子一旦被转染到细胞，特别是哺乳动物细胞时由其引 起的潜在的细胞免疫应答，用mRNA成功重编程非人源细胞一直难以 实现。在重编程人成纤维细胞的过程中，通常的做法是使用一种病毒 蛋白作为诱饵受体使转染的mRNA分子诱导的干扰素减效。然而，使 用诱饵受体的这种策略或其它类似策略都没有成功地将源自非人类物 种，包括狒狒、马和狗的成纤维细胞重编程。

因此，为了解决这些缺陷，本公开提供了用于生成能够产生身体 的所有的不同组织的干细胞的方法和组合物。在某些方面，使用信使 RNA分子且不需要病毒载体或饲养层细胞，本文公开的方法可用于将 非人源成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSC)。与之前报道的 细胞重编程方法学相比，使用的示例性方法和组合物产生了令人惊讶 的和意想不到的改进效率，并且克服了先前未解决的在非人类哺乳动 物细胞中抑制细胞免疫反应的问题。

因此，提供了方法、试剂和/或组合物，其可用于通过改进重编程 因子(RF)混合物，特别是通过应用常规重编程因子，如Oct4(也被 称为Oct3/4)，Sox2等的工程化变体，并结合已知的强转录因子如VP16 和MyoD的反式激活结构域而加速mRNA介导的重编程。本文所公开 的方法和组合物得到了一个无饲养层的方案，其极大地减少了涉及基 于mRNA的重编程的时间，成本和精力。