[发明专利]治疗由OPA1单倍剂量不足引起的疾病的人工转录因子

说明书

发明领域

本发明涉及人工转录因子，其包含融合至激活性结构域的特异性靶向OPA1基因启动子的多指锌指蛋白和核定位序列，以及涉及它们在治疗由导致单倍剂量不足的OPA1突变引起的诸如常染色体显性视神经萎缩(ADOA)或综合征性ADOA+(syndromicADOAplus)的疾病中的用途。

背景技术

提出人工转录因子(AFT)是用于调制基因表达的有用工具(SeraT.,2009,AdvDrugDelivRev61,513-526)。许多天然存在的转录因子，通过抑制或激活基因转录来影响基因表达，具有识别某一DNA序列的复杂的特定结构域。如果技术人员意在修饰它们的特异性和一个或多个靶基因，则这使得它们对于操作而言是无吸引力的目标。然而，某一类转录因子含有几个所谓锌指(ZF)结构域，它们是模块化的，并因此使得它们可以进行遗传工程化。锌指是几乎独立靶向三个DNA碱基对的短的(30个氨基酸)DNA结合基序。含有融合在一起的几个此类锌指的蛋白因此能够识别更长的DNA序列。六聚锌指蛋白(ZFP)识别18个碱基对(bp)的DNA靶标，其在整个人类基因组中几乎是独一无二的。最初认为是完全背景独立的，但更深入的分析显示对于锌指的某些背景特异性(KlugA.,2010,AnnuRevBiochem79,213-231)。突变在锌指识别表面中的某些氨基酸改变ZF模块的结合特异性产生对于大部分的5’-GNN-3’，5’-CNN-3’，5’-ANN-3’和某些5’-TNN-3’密码子的确定的ZF结构单元(例如所谓的Barbas模块，见DreierB.,BarbasC.F.3rd等,2005,JBiolChem280,35588-35597)。尽管关于人工转录因子的早期工作集中于基于组合预先选择的锌指与已知的3bp靶序列的合理设计，但实现锌指的某一背景特异性需要产生大的锌指文库，其使用复杂方法诸如细菌或酵母单杂交、噬菌体展示、区室化核糖体展示(compartmentalizedribosomedisplay)或使用FACS分析的体内选择来询问。

使用此类人工锌指蛋白，可以以高特异性靶向在人类基因组内的DNA基因座。因此，这些锌指蛋白是将具有转录调制活性的蛋白结构域转运至特定启动子序列以产生目标基因表达的调制的理想工具。用于激活基因转录的合适结构域是单纯疱疹病毒VP16(SEQIDNO:1)或VP64(VP16的四聚体重复,SEQIDNO:2)结构域(BeerliR.R.等,1998,ProcNatlAcadSciUSA95,14628-14633)。认为赋予转录激活的其他结构域是CJ7(SEQIDNO:3)、p65-TA1(SEQIDNO:4、SAD(SEQIDNO:5)、NF-1(SEQIDNO:6)、AP-2(SEQIDNO:7)、SP1-A(SEQIDNO:8)、SP1-B(SEQIDNO:9)、Oct-1(SEQIDNO:10)、Oct-2(SEQIDNO:11)、Oct-2_5x(SEQIDNO:12)、MTF-1(SEQIDNO:13)、BTEB-2(SEQIDNO:14)和LKLF(SEQIDNO:15)。此外，认为通过基因本体论GO:0001071(http://amigo.geneontology.org/cgi-bin/amigo/term_details？term＝GO:0001071)限定的蛋白的转录活性结构域实现靶蛋白的转录调节。

尽管由于特定特征的高保守性，小分子药物并非总能选择性靶向给定蛋白家族的某一成员，但如基于抗体的新药物所显示出的，生物制剂提供了巨大的特异性。然而，实际上所有生物制剂到目前为止均在细胞外起作用。尤其是上文提及的人工转录因子将适合于以治疗上有用的方式影响基因转录。然而，此类因子向作用位点－细胞核－的递送并不容易实现，因而妨碍了治疗性人工转录因子方法的有效性，例如通过依赖于逆转录病毒递送具有该方法的所有缺点，诸如免疫原性和细胞转化的可能性(LundC.V.等,2005,MolCellBiol25,9082-9091)。