[发明专利]禽类胚胎细胞的制备

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年3月5日提交的美国申请编号13/785513的权益。

本发明涉及由禽胚制备细胞的组合物和方法。本发明还涉及这些细胞的培养物及其用途，尤其是用于生产病毒如MDV的用途。本发明还涉及使用这些细胞或病毒制备疫苗的方法。

背景技术

受精的禽蛋，如鸡蛋，是生产人类和兽用疫苗的主要基质之一。使用它们的原因是它们能够支持包括复制缺陷型病毒的多种多样的人和动物病毒的复制。在禽类胚胎细胞中生产的疫苗的实例包括例如MDV疫苗、禽呼肠孤病毒疫苗和传染性法氏囊病病毒疫苗。

在禽类胚胎细胞中生产疫苗需要由无特定病原体的(SPF)禽群持续可靠地提供受精卵。SPF禽群被饲养于特殊环境下并且定期被证明为无禽类病原体(D.H.Thornton，“马立克氏病：科学依据和控制方法：疫苗的质量控制和标准化(Marek′sDiseases：ScientificBasisandMethodsofControl：qualitycontrolandstandardizationofvaccines.)”(L.N.Payne，Ed.)，MartinusNijoffPublishing，波士顿，MA，第267-292页(1985))。从蛋中获得胚胎，将其断头，然后进行处理(通常通过机械和/或酶处理)从而生产初生胚胎细胞，通常是胚胎成纤维细胞。通常，将胚胎与头分离并收集在烧杯中。然后将仅有身体的胚胎转移至胰蛋白酶培养瓶，其中在冷胰蛋白酶(比室温冷)中所述胚胎被胰蛋白酶化(trypsinized)3次，每次10分钟。将包含分离的细胞的消化缓冲液倾倒通过筛网(1mm目径)至含血清的酸瓶中。通过离心浓缩收集的CEF，并且将其冷冻直至使用。

然后可以培养这些细胞并将其用于生产病毒。

例如，目前的马立克氏病疫苗是感染的鸡胚细胞(CEF)的悬液，或由感染有马立克氏病病毒疫苗株的超声粉碎的CEF制得的无细胞病毒悬液(A.E.Churchill，“马立克氏病：科学依据和控制方法：疫苗的生产(Marek′sDiseases：ScientificBasisandMethodsofControl：Productionofvaccines)”(L.N.Payne，Ed.)，MartinusNijoffPublishing，波士顿，MA，第251-266页(1985))。

与所有初生动物细胞一样，禽胚成纤维细胞会经历衰老，倍增时间逐代增加直至细胞最终死亡。初生禽胚细胞如鸡胚细胞(CEF)的有限寿命为大约两到三周。因此，为了维持疫苗生产，必须每隔一或两周制备这些细胞，这增加了生产疫苗的成本。

为了克服对初生细胞的需要及对受精卵的使用，已经尝试开发永生化的禽类细胞系(参见例如K.Nazerian，AvianPathol.16：527-544(1987))。然而，这些细胞系来自病毒转化的细胞，或在接种到鸡中时产生肿瘤，或产生不足以商业生产的病毒滴度。因此，在疫苗生产中这些细胞系不能替代初生禽胚成纤维细胞。

本发明提供了一种改进适合于疫苗生产的禽类胚胎细胞生产的可选方法。本发明公开了一种用于从完整胚胎生产适合疫苗接种的初生禽类细胞的改进方法。该方法提高了产生的细胞的数量且因此降低了疫苗生产的成本。

发明内容

本发明涉及生产初生禽胚细胞的改进方法。本发明还涉及这些细胞及其生产疫苗或其它生物产品的用途。

本发明尤其源于从完整胚胎生产细胞的新方法的开发。呈现的结果显示这种方法提供了提高的每个胚胎的细胞数量，并且显示这些细胞展示了适于商业疫苗生产的特征(密度、融合度、病毒生产滴度)。更具体地呈现的结果显示该方法产生的CEF/胚胎产量是现有技术实现的产量的大约两倍，并且允许以更高的密度接种细胞，和在感染后大约50小时进行收获，从而实现高于最低释放量的滴度。因此与使用建立的细胞系或常规仅有身体的胚胎细胞的现有技术的方法相比，这种方法具有很大优势。

因此本发明的一个目的在于制备禽类胚胎细胞的方法，其包含：

a)由禽蛋获得禽胚，和

b)由完整胚胎制备细胞。

在一个优选的实施方案中，该方法还包含步骤c)：以20微米以上，更优选以50微米以上对细胞制备物进行过滤。

本发明的另一个目的在于由胚胎制备禽类胚胎细胞的改进的方法，改进在于由完整胚胎制备细胞及随后以20微米以上过滤细胞制备物。