[发明专利]细胞内表型筛选

说明书

本发明涉及用于鉴定涉及细胞表型的细胞靶标的方法，包括鉴定能修饰细胞表型的胞内抗体和鉴定胞内抗体的直接或间接的细胞靶标。本发明还涉及能抑制由过敏性刺激引发的肥大细胞上的脱颗粒反应的胞内抗体，尤其是涉及胞内抗体3H2-1、3H2-VH和5H4，并且具体涉及胞内抗体3H2-1和5H4，其能够直接或间接地分别靶向ABCF1家族的蛋白和C12ORF4家族的蛋白。本发明还涉及ABCF1和C12ORF4抑制剂，其用于治疗中的用途，尤其是用于治疗过敏和/或炎症状况。

对与给定表型有关的细胞靶标的鉴定是更好地理解该表型潜在的细胞机制的基本前提。具体而言，鉴定与医疗状况有关的细胞靶标是制药工业的巨大兴趣所在，因为其使得能够设计新的治疗，所述治疗对这些靶标有效果，并能用于治疗或诊断医疗状况。细胞表型可能经常与给定的病理学有关。因此，能够允许对修饰细胞表型的分子进行鉴定的测定(表型筛选)能对药物设计有巨大帮助。对与给定表型有关的新细胞靶标的鉴定对其他行业也是重要的，例如在化妆品中或在植物和食品工业中。

理解已知或未知的细胞分子在给定表型中起的作用并不是件容易的事，这尤其是因为细胞途径是高度复杂的并且因为许多细胞内分子在若干不同的细胞途径中起作用。因此，使靶蛋白失活(例如通过RNA干扰)能对一些细胞途径具有调节作用并且因此产生一些伴随的表型效应，所述表型效应可能彼此难以区分。此外，许多细胞蛋白能呈现不同的构象和/或可以包含翻译后修饰如磷酸化的氨基酸，并且因此可以与或不与另一个分子相互作用，作为它们的构象的功能或翻译后修饰的功能。因此，能够允许对那些造成给定表型的细胞靶标进行筛选，并且甚至对呈特定构象和/或经修饰的或未经修饰的状态的靶标进行筛选而不使这些细胞靶标完全失活的技术，对于更好地理解一些细胞途径是具有极高价值的工具。

抗体可被视为精密工具，因为它们对它们的靶标是高度特异性的，并且能针对蛋白的几乎任何部分产生，并且尤其是针对较大的平面区域(蛋白相互作用常在此处发生，并且其更难用小有机分子或肽靶向)产生。然而，天然抗体不适应于细胞内环境，因为它们的尺寸大并且因为细胞质的还原环境阻止了二硫桥的形成，并因此阻止了抗体的适当折叠。已经开发了重组抗体，其中包括scFv、双抗体和sdAb，用于细胞内环境中的表达。将它们称为“细胞内抗体”或“胞内抗体”。

发明人的团队近期所描述的一个应用，是将根据其对靶抗体(或“Ab”)的调节效果预先选出的胞内抗体用于筛选小分子文库的用途(欧洲专利EP1743178B1)。其目的在于分离出能模拟感兴趣的scFv的细胞内作用并且可以体内使用的候选药物。发明人将Ab的这种ELISA置换应用在过敏模型中。同一团队此前的工作已分离出了针对酪氨酸激酶Syk的SH2结构域的scFv，所述结构域与肥大细胞激活的早期阶段有关。已经显示，这种scFv在肥大细胞系中的细胞内表达抑制了由IgE受体激活所诱导的过敏递质(mediator)的释放，而不干扰Syk的激酶活性(Dauvillier等，2002)。开发出了Ab置换测定(Abdisplacementassay)来分离抗-SykscFv的分子模拟物。以这个方式，对3000种分子的化学文库进行筛选，结果鉴定出了一种分子，指定为C-13。这种分子具有高抗过敏潜能，因为进一步的研究证明了其在小鼠中体外抑制肥大细胞激活的能力以及体内抑制过敏性休克的能力(Mazuc等，2008)。通过结构分析和定向诱变还鉴定出了C-13与Syk相互作用的位点。在Syk的两个SH2结构域之间的界面处鉴定出的腔(cavity)被用于对500000种分子的文库进行计算机中的(insilico)第二次筛选。以这种方式，按照其抑制过敏递质释放的能力选出了85种非酶的Syk抑制剂(Villoutreix等，2011)。

Inoue等(2011)描述了用随机化的细胞内骆驼科动物V_HH文库进行的功能缺失筛选。作者认为常规V_H结构域在细胞内环境中是不可溶的。在相应的日本专利申请JP2008-136455中，Inoue等的作者也认为scFvs在细胞内功能缺失筛选的背景下是无用的，因为其细胞内稳定性和功能性低。

发明人开发出了基于使用细胞内抗体(或“胞内抗体”)的新的表型筛选技术，用于鉴定能对细胞途径起作用并调节感兴趣的表型的细胞靶标。本工作描述了首例用细胞内人抗体片段在哺乳动物细胞中进行的表型选择。