[发明专利]细胞内表型筛选

权利要求书

1.用于鉴定涉及细胞表型的细胞靶标的方法，该方法包括：

a)鉴定包含免疫球蛋白的完整V_H和/或V_L结构域的胞内抗体，当其存在于细胞内时其能诱导、修饰或抑制所述表型；

b)鉴定细胞靶标，其是所述细胞中所述胞内抗体的直接或间接靶标；并任选地

c)分离所述细胞靶标。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤a)包括筛选细胞内表达的胞内抗体文库，其中所述胞内抗体包含免疫球蛋白的完整V_H和/或V_L结构域。

3.根据权利要求1或2的方法，其中步骤a)包括：

i)获得分子文库，其中来自文库的每个分子编码不同的胞内抗体，所述胞内抗体包含免疫球蛋白的完整V_H和/或V_L结构域；

ii)对具有步骤i)的分子文库的细胞群进行转染；

iii)在足以获得可检测的对所述表型的诱导、修饰或抑制的时间和条件下培养经转染的细胞；

iv)将显示出对所述表型的诱导、修饰或抑制的步骤iii)的细胞选出；

v)任选地，在选自步骤iv)的细胞上或在再克隆自选自步骤iv)的细胞的细胞上重复步骤iii)和iv)，以进行一轮或多轮额外的选择；和

vi)鉴定引起对所述表型的诱导、修饰或抑制的胞内抗体。

4.根据权利要求3的方法，其中所述方法包括至少一轮选择后的再克隆步骤，以及对再克隆的细胞进行一轮或多轮选择。

5.根据权利要求3或4的方法，其中所述编码胞内抗体的分子是载体。

6.根据权利要求5的方法，其中所述载体是整合载体如逆转录病毒载体。

7.根据权利要求2-6中任一项的方法，其中所述胞内抗体文库和/或所述分子文库是通过对在细胞内是功能性的胞内抗体进行选择，然后在其一个或多个CDR区中引入修饰而获得的。

8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述胞内抗体的所述直接或间接靶标结合至所述胞内抗体或能与所述胞内抗体一起被免疫沉淀。

9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中所述胞内抗体是scFv、包含至少一个完整V_H或V_L结构域的截短的scFv、双抗体(diabody)、完整V_H结构域或完整V_L结构域。

10.根据权利要求1-9任一项的方法，其中所述完整V_H结构域和/或完整V_L结构域来源于人抗体。

11.根据权利要求1-10任一项的方法，其进一步包括：

-用RNA干扰技术或所述细胞靶标的已知抑制剂进行靶标确认的步骤；和/或

-鉴定所述细胞靶标的表位或活性位点的步骤；和/或

-鉴定分子的步骤，所述分子与步骤a)中鉴定出的胞内抗体对步骤b)中鉴定出的靶标的结合进行竞争，并且所述分子能够修饰所述细胞表型。

12.根据权利要求1-11任一项的方法，其中所述细胞是真核细胞，优选为哺乳动物细胞如人细胞。

13.根据权利要求12的方法，其中所述真核细胞是涉及过敏、炎症或二者均涉及的细胞，并且其中所述表型是关于过敏反应、炎症反应或与二者均有关的表型。

14.包含scFv5H4的V_H结构域的CDR3序列“DGGLREGFDC”的胞内抗体。

15.根据权利要求14的胞内抗体，其进一步包含scFv13R4的V_H结构域的CDR1序列和CDR2序列。

16.根据权利要求14的胞内抗体，其中所述胞内抗体是胞内抗体5H4(SEQIDNO:3)、5H4-V_H(SEQIDNO:4)或5H4-V_L(SEQIDNO:5)。

17.胞内抗体，其包含scFv3H2-1的V_H结构域的CDR3序列“PIAVSDY”。