[发明专利]作为体内造血刺激剂的TAT‑HOXB4H重组蛋白质的制备方法

说明书

本申请是申请日为2008年5月27日、申请号为200810111350.X的发明创造名称为“作为体内造血刺激剂的TAT-HOXB4H重组蛋白质及其医疗组成物”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种C-端含有组胺酸标记的HOXB4重组蛋白质，特别涉及一种C端含有六个组胺酸残基(residue)的重组蛋白质方法，所述方法制备的重组蛋白质的组合物可应用在制备用于活体内投药以促进造血干细胞由骨髓动员至周边血液的药物。

背景技术

在再生医学发展蓬勃的今日，各种关于寻找器官特异干细胞或可自我更生(self-renewing)细胞的研究不断。所述可自我更生细胞中最常被研究的是造血干细胞，因为从癌症、新陈代谢疾病到免疫不全，造血干细胞皆是较好的治疗选择。

“造血”是指血液细胞生成的过程，可通过位于骨髓中的造血干细胞的分裂而取代红血球及白血球。造血干细胞(HSCs)是一群具有自我更新能力与分化为所有血球或免疫细胞能力的细胞。然而，控制造血干细胞自我更新与分化的基因机转多半仍属未知。

目前，自成人骨髓、动员后周边血液以及脐带血移植的人类造血干细胞，已在临床上用于治疗血癌(白血病与淋巴瘤)，以及用于帮助免疫系统由非血癌的高剂量化疗复原。然而有效的移植需要大量的不同来源的造血干细胞，并且可能需要进行干细胞增生(expansion)。

造血干细胞可来自骨髓、周边血液以及脐带血。取出骨髓细胞需要进行手术以及相当痛苦的步骤，因而成为较差的手段。使用周边血液细胞也有缺陷，因为很难由造血机能受损的罹病或化疗患者取得合适与足量的造血干细胞。脐带血相对容易取得并且造血干细胞的质量也较好，然而此法所能取得的造血干细胞数量仍有限。每次取得的细胞数量足够用于小孩，但要用于成人就可能不足。为解决上述问题，就必须干扰干细胞自我更生过程来加速造血干细胞体外增生。

新近的证据指出转录调控因子在调控干细胞的基因表现、与干细胞的发育过程扮演重要角色(Orkin、S.H.Nat.Rev.Genet 1,57-64、2000)。转录调控因子可通过与目标基因的结合与否或是本身浓度来构成复杂的细胞生理调控机制。一群称为DNA binding homebox(HOX)的转录因子被发现在胚胎发育扮演重要角色，并且在近年来发现HOX转录因子家族在造血干细胞发育也扮演了重要角色(Buske、C.et.al.J.Hematol.71,301-308、2000)。蒙特娄大学(University of Montreal)的盖·萨瓦格(Guy Sauvageau)博士曾经探讨骨髓中造血干细胞的HOX转录因子调控造血干细胞更新的现象，它的研究显示同位序列基因(homeobox gene)HOXB4对于造血干细胞自我更新的调控十分重要，可维持造血干细胞在骨髓中的群集大小。最早证明HOX基因会在血球细胞表现，是利用人类及老鼠的细胞株(cell line)而证实的。有些HOX基因在不同的细胞形态有明显广泛的表现，有些HOX基因则只活化表现于特定细胞中。例如：人类的HOXB串群中的八个成员会在红血球细胞发育之初表现，有些HOXB基因包括HOXB4及HOXB7也会在T细胞及B细胞表现。Sauvageau等人证实有九个HOXA基因、八个HOXB基因及四个HOXC基因会在CD34⁺骨髓细胞内表现，其中又以HOXB2、HOXB9及HOXA10在CD34⁺的细胞族群内的红血球原始细胞表现最多。另外，实验结果也检测出在CD34^－的细胞群中，没有HOX基因表现。因此，“HOXB4”蛋白已最常被用于做为活体外造血干细胞(HSC)增生之有效刺激剂。近来已证实人类，“HOXB4”基因可以病毒或重组蛋白质形式来有效增生造血干细胞。TAT-HOXB4H重组蛋白质，在实验室等级，已被用于增生干细胞而不会有反转录病毒插入之风险或与骨髓基质细胞共培养之风险(参见Krosl、J.et al.、Nature Medicine 9、1428-1432、2003)。因此，“HOXB4”蛋白已常用于做为促进活体外造血干细胞增生的刺激剂。