[发明专利]一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体及其筛选方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物学领域，尤其涉及一种新型三疣梭子蟹呼肠孤病毒(SCRV)受体以及利用受体蛋白抗体进行对SCRV病毒感染的防治。

背景技术

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一种重要的海洋经济动物，肉味鲜美、营养丰富，深受广大消费者的青睐，也是重要的出口创汇品种。目前三疣梭子蟹是世界上养殖规模最大的海洋经济蟹类。近年来，秋冬季节常出现由梭子蟹呼肠孤病毒引起的疫病使梭子蟹大量死亡的现象，给养殖产业带来重要的经济损失。所述的三疣梭子蟹呼肠孤病毒的毒株为R1015株，保藏号为CGMCC No.5379，于2011年10月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。(类)呼肠孤病毒是中华绒螯蟹(Eriocheir sinensi)、锯缘青蟹(Scylla serrata)和三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的重要病原，哺乳动物呼肠孤病毒受体研究较系统深入而蟹类呼肠孤病毒受体研究尚未被报道。

由于病毒受体及病毒与受体间的互作是病毒感染的关键点而受到广泛的重视从而成为研发热点，已有众多人、畜、禽病毒的细胞受体被阐明，而水生动物病毒受体研究远落后于人、畜、禽病毒。主要的报道有牙鲆淋巴囊肿病毒、WSSV和海洋双RNA病毒Marine birnavirus(MABV)。水生生物呼肠孤病毒与细胞受体互作方面，寥有的几篇报道主要是关于草鱼呼肠孤病毒的。通过对三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体的研究对预防及控制该病毒提供有效策略。

病毒受体的研究方法比较多，如从基因水平上入手的方法有酵母双杂交技术、克隆表达技术、噬菌体展示技术等。从蛋白质水平入手的方法，如病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)、免疫共沉淀技术等，这些方法的优点是直接、客观。目前，国内外还没有公开任何关于三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体及该受体的阻断抑制剂的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体，同时利用该受体蛋白免疫小鼠所得到的抗体作为受体阻断剂，该阻断剂对三疣梭子蟹呼肠孤病毒感染细胞有抑制活性，可以开发防治三疣梭子蟹呼肠孤病毒感染的药物。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体，所述的受体为微管蛋白。

上述三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体的筛选方法，具体步骤如下：

(1)将健康的三疣梭子蟹冰上解剖取其鳃，按质量体积比1g：(5–10)ml加入到预先冰浴过的含有1mM苯甲基磺酰氟的膜蛋白提取液中匀浆，将匀浆液于4℃，600g离心3min，取上清液于4℃，6000g离心5min后，再取上清液于4℃，35000g离心2h，将得到的沉淀用膜蛋白提取液重悬，即得到三疣梭子蟹鳃膜蛋白提取液；

(2)将三疣梭子蟹鳃膜蛋白提取液进行8％SDS-PAGE电泳后，在电转液中将凝胶上所有蛋白条带转移至PVDF膜上，300mA，4℃转移3h，转移结束后，将PVDF膜从电转槽中取出，用去离子水与PBST缓冲液稍加漂洗后，浸没于20-25ml封闭液中，40r/min室温摇动封闭过夜，将封闭过夜的PVDF膜用PBST缓冲液洗3次，每次5min，将洗涤后的PVDF膜放入塑料袋中，加1mL12.9ug/ml三疣梭子蟹呼肠孤病毒，用封口机封住，室温摇动孵育1h后，用PBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次5min；然后将PVDF膜置于鸡抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒一抗稀释液中，在室温下摇动孵育2h，再用PBST缓冲液洗涤3次，每次5min；再将PVDF膜置于HRP-羊抗鸡二抗稀释液中，在室温下缓慢摇动孵育1h，再用PBST缓冲液洗涤3次，每次10min后，将PVDF膜用PBS缓冲液洗5min后，用邻苯二胺在37℃下避光显色15min，PVDF膜上显色的蛋白条带为三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体。

步骤(1)中所述的膜蛋白提取液的配制方法如下：pH 8.0的1mol/L Tris-HCl 100ml、MgCl₂·6H₂O 0.4063g、0.1mol/L EDTA 10ml、TritonX-100 2ml，补足双蒸水至1L，高压灭菌。