[发明专利]一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体及其筛选方法和应用

权利要求书

1.一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体，其特征在于：所述的受体为微管蛋白。

2.一种根据权利要求1所述的三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体的筛选方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）取健康的三疣梭子蟹冰上解剖取其鳃，按质量体积比1 g：（5 –10）ml加入到预先冰浴过的含有1mM 苯甲基磺酰氟的膜蛋白提取液中匀浆，将匀浆液于4℃，600g离心3min，取上清液于4℃，6000g离心5min后，再取上清液于4℃，35000g离心2 h，将得到的沉淀用膜蛋白提取液重悬，即得到三疣梭子蟹鳃膜蛋白提取液；

（2）将三疣梭子蟹鳃膜蛋白提取液进行8%SDS-PAGE电泳后，在电转液中将凝胶上所有蛋白条带转移至PVDF膜上，300mA，4℃转移3h，转移结束后，将PVDF膜从电转槽中取出，用去离子水与PBST缓冲液稍加漂洗后，浸没于20-25ml封闭液中，40r/min 室温摇动封闭过夜，将封闭过夜的PVDF膜用PBST缓冲液洗3次，每次5min，将洗涤后的PVDF膜放入塑料袋中，加1mL12.9ug/ml 三疣梭子蟹呼肠孤病毒，用封口机封住，室温摇动孵育1h后，用PBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次5min；然后将PVDF膜置于鸡抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒一抗稀释液中，在室温下摇动孵育2h，再用PBST缓冲液洗涤3次，每次5min；再将PVDF膜置于HRP-羊抗鸡二抗稀释液中，在室温下缓慢摇动孵育1h，再用PBST缓冲液洗涤3次，每次10min后，将PVDF膜用PBS缓冲液洗5min后，用邻苯二胺在37℃下避光显色15min，PVDF膜上显色的蛋白条带为三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体。

3.根据权利要求2所述的一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体的筛选方法，其特征在于步骤（1）中所述的膜蛋白提取液的配制方法如下：pH 8.0的1mol/L Tris-HCl 100ml、MgCl₂·6H₂O 0.4063g、0.1mol/L EDTA 10ml 、TritonX-100 2ml，补足双蒸水至1L，高压灭菌。

4.根据权利要求2所述的一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体的筛选方法，其特征在于步骤（2）中所述的电转液配制方法为：Tris 3g、甘氨酸 14.4g，甲醇200ml，补足双蒸水至1L；所述的封闭液为含5wt%脱脂牛奶的PBST缓冲液；所述的鸡抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒一抗稀释液为鸡抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒一抗用含0.5wt% 脱脂牛奶的PBST缓冲液稀释1000倍所得；所述的HRP-羊抗鸡二抗稀释液为HRP-羊抗鸡二抗用含0.5wt% 脱脂牛奶的PBST缓冲液稀释5000倍所得。

5.根据权利要求4所述的一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体的筛选方法，其特征在于所述的PBST缓冲液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、 KH₂PO₄ 0.2g，500μL吐温-20，补足双蒸水至1L，调节pH至7.4，高压灭菌；所述的PBS缓冲液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、 KH₂PO₄ 0.2g，补足双蒸水至1L，调节pH至7.4，高压灭菌。

6.一种根据权利要求1-5中任一项所述的三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体的用途，其特征在于：权利要求1所述的微管蛋白在制备用于阻断SCRV病毒感染细胞的受体阻断剂方面的用途。