[发明专利]一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒。

背景技术

犬细小病毒病是危害我国养犬业的主要流行型传染病之一，是犬的一种具有高度接触性的烈性传染病，具有发病急和死亡率高等特点，不同品种和年龄的犬都易感，幼犬在l6周龄左右感染率高达100％，死亡率达 10％~50％。中国宠物市场的发展和进步，是社会经济发展、人们对宠物的态度以及人口老龄化和城市化进程综合促进的结果。犬作为一种与人类接触最为亲密的、与人类相处时间最长的宠物之一，与人类的日常生活已经密不可分，其健康状况往往与人类自身的健康状况息息相关，诸如犬是多少人畜共患的寄生虫、病毒和细菌性病原的宿主和可能的传染源，因此，关注宠物犬的健康对于动物福利和人类健康具有重要的公共卫生意义。犬除了作为宠物饲养之外，其在生命科学、军用犬已经试验动物用途中越来越广泛。

我国广泛存在并已分离多种毒株，对于其特异性抗体的检测方法主要有血凝抑制试验（HI），酶联免疫吸附法（ELISA），胶体金法。其中血凝抑制试验（HI），需要新鲜的猪、猴的红细胞，材料来源不及时、批次制备原料不稳定、难以高通量检测，操作人为因素影响大，而仅限于个别实验室内部使用，无法批量工业化生产，而不能推广到基层养殖场和宠物医院临床一线检测之用。胶体金便于临床定性分析犬细小病毒抗体阳性与阴性问题，而无法做到精确定量。ELISA是一项国内外通用的，目前在各个检测领域技术最为成熟的一种方法，商品化的试剂盒也非常好用。然而，目前国内的技术力量没有达到相应的国际水平，迟迟没有中国自己的犬细小病毒ELISA抗体检测试剂盒上市。而进口犬细小病毒ELISA抗体检测试剂盒价格昂贵，临床应用成本高，在国内难以普遍推广使用。

鉴于上述情况，开发一种能够适合工业化批量生产、质量可控、性能稳定、高通量、特异性和敏感性好的犬细小病毒抗体检测试剂盒十分必要，更为重要的是，该试剂盒的成本不能太高，否则，难以推广应用。基于以上种种背景，建立了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒，能够快速、准确的进行检测。

本发明为解决上述问题所采取的技术方案是：一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒，该试剂盒内设有包被犬细小病毒抗原的96孔免疫检测反应板5块、120mL10倍浓缩洗涤液1瓶、120mL样品稀释液1瓶、50 μL阳性血清1管、50 μL阴性血清1管、20 μL辣根过氧化物标记的SPA酶标抗体1管、60mL底物显色液A液1瓶、1.5 mL每管的底物显色液B液2管。

所述包被犬细小病毒抗原96孔免疫检测反应板的制备方法，包括以下步骤：

（1）、将培养瓶中单层猫肾细胞的培养基倒掉，然后向培养瓶中加入PBS洗涤液，每cm2单层猫肾细胞对应的PBS洗涤液为0.027mL，之后摇动培养瓶，使洗涤液覆盖单层猫肾细胞面，以除去培养瓶中残留的培养基，倒掉PBS洗涤液后备用；

（2）、向步骤（1）处理过的培养瓶中加入质量浓度为0.25%的胰酶-EDTA-Na2溶液，每cm2单层猫肾细胞对应的胰酶-EDTA-Na2溶液为0.013mL，摇动培养瓶，直至胰酶-EDTA-Na2溶液覆盖单层猫肾细胞，室温下静置1min后，倒掉瓶中的胰酶-EDTA-Na2溶液，再静置2min，振动培养瓶直至单层猫肾细胞全部脱落，备用；

（3）、向步骤（2）处理过的培养瓶中加入MEM培养基，且MEM培养基中胎牛血清的质量浓度为5%，用移液枪吹散猫肾细胞，直至猫肾细胞呈单个分布，即制得细胞悬液，备用；

（4）、将细胞悬液与胎牛血清质量浓度为5%的MEM培养基按1:5的体积比混合并搅拌均匀，制得培养液，将基因型为2a型的犬细小病毒液加入到培养液中，使每孔病毒感染复数为5TCID50，混合并搅拌均匀后制得包被液，备用；

（5）、用排枪吸取步骤（4）制备的包被液，并以每孔120μL加入到96孔免疫检测反应板中，振动免疫检测反应板，使包被液在孔内均匀分布，之后放入温度为37℃、CO2体积浓度为5%的培养箱中培养48h，将96孔免疫检测反应板中的包被液倒掉，并用PBS洗涤溶液清洗3-4次，在温度为30℃的真空干燥仪内干燥，直至孔边缘处出现白色圈；

（6）、向步骤（5）处理过的96孔免疫检测反应板中加入固定液，静置30min后弃去固定液，放入温度为30℃的真空干燥仪内干燥，直至孔边缘出现白色圈，所述固定液是将丙酮与PBS洗涤溶液按33:67的体积比混合并搅拌均匀后制得；