[发明专利]基于硝基还原酶的电化学酶联免疫方法测定三聚氰胺

说明书

技术领域

本发明属于食品安全检测和分析仪器技术领域，具体涉及利用电化学聚合信号放大和酶联免疫技术对乳制品中三聚氰胺含量的测定方法。

背景技术

       三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，为提高乳制品中粗蛋白含量，不法商贩在乳品原料中非法添加三聚氰胺，由于三聚氰胺在高温下可能分解产生氰化物，毒性较强，长期摄入三聚氰胺，其在动物体内代谢很快且不会存留，主要影响泌尿系统，会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。三聚氰胺传统的检测方法有色谱法、光谱法等。此类方法需要大型仪器设备，操作成本较高，不适合高通量的筛选和快速检测。而酶联免疫试剂盒检测法，虽然操作方法较为简便，但是检测手段依旧需要光学仪器，不适合于现场快速检测。电化学酶联免疫的方法就是将电化学分析与免疫学方法的优点相结合起来的生物传感检测方法，是在免疫学具有特异性强的基础上，通过检测免疫反应形成的抗原-抗体复合物，以电化学测定酶促反应底物信号从而进行样本含量分析。在电化学-酶联免疫法中一般使用辣根过氧化物酶标记二抗，检测酶反应底物的电化学电化学合物，以电化学检测仪器易于小型化，操作简单等特点信号。而基于硝基还原酶标记二抗的电化学-酶联免疫方法未见报道。

       基于丝网印刷电极的电化学方法具有灵敏度高，仪器易于小型化，操作简单等优点，在食品安全检测领域获得应用，并且丝网印刷电极易微型化，可直接与酶联免疫反应中用到的多孔酶标板联用，形成一体化的检测装置。近年来，基于纳米材料的电化学信号放大技术成为电化学生物传感领域的研究热点，其中一种的重要方法为掺杂纳米材料如碳纳米管对电活性物质进行电聚合而获得更加灵敏的电化学信号。石墨烯由于其独特的物理和化学性质，在电子学、能量存储转换、生物科学与技术、特别是电化学传感器等各方面得到大量的应用，同时石墨烯的优良的电催化活性适用于电化学聚合信号放大策略的构建。

发明内容

       本发明克服现有技术不足，提出了一种基于电化学聚合信号放大的酶联免疫方法，并应用在乳制品中三聚氰胺的快速、灵敏的定量检测中。

       为实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案：

       一种基于电化学聚合信号放大的酶联免疫方法检测乳制品中三聚氰胺，将三聚氰胺标准品或样品和三聚氰胺抗体一同放置在包被有三聚氰胺半抗原的多孔酶标板孔中进行竞争免疫反应，形成抗原-抗体复合物后加入酶标二抗与抗体进行反应。反应后加入酶促反应底物。酶反应完成后向孔中加入石墨烯作为电解质，并将丝网印刷电极插入其中进行电化学聚合。聚合完成后将电极取出，在电极表面滴加电解质溶液，检测电极表面形成的纳米复合物的放大的电化学信号，从而检测样品中三聚氰胺的含量。

       所述多孔酶标板为市售96孔或24孔酶标板。

       所述三聚氰胺半抗原可采用戊二醛偶联法制备。所述三聚氰胺抗体为兔抗三聚氰胺多克隆抗体。

       所述竞争免疫反应采用如下步骤：用碳酸盐缓冲溶液稀释三聚氰胺半抗原，加入到孔板中4℃静置过夜并洗涤晾干，此时三聚氰胺半抗原被包被在孔板中，用1%BSA在37℃下封闭1小时，封闭完成后洗涤晾干。将三聚氰胺标准品或待检样品，加入酶标板孔内，再加入三聚氰胺抗体混匀，37℃反应后洗涤晾干。在此过程中，包被在酶标板上的三聚氰胺半抗原和三聚氰胺一起与抗体竞争反应，发生竞争免疫反应，在孔板上最终形成抗原-抗体复合物。

       所述酶标二抗为硝基还原酶标记羊抗兔IgG抗体，可用戊二醛偶联法将硝基还原酶与二抗偶联制得。所述酶促反应底物为硼氢化钠与邻硝基苯酚。

       所述酶反应如下：在硝基还原酶的催化作用下，硼氢化钠将无法电聚合的邻硝基苯酚还原成可电化学聚合的邻氨基苯酚。

       所述丝网印刷电极制作方法如下：以聚丙烯纸为基底，依据设计图形，通过丝网印刷分层印制银浆、碳浆，氯化银浆和绝缘浆。电极为三电极体系，电极尺寸为0.5mm×6mm×28mm。

       所述电化学聚合反应如下：将1mg/mL的石墨烯水溶液加入到酶促反应后的溶液中混匀，插入丝网印刷电极，用循环伏安法在－0.2V至1.2V范围内扫描10圈，进行电化学聚合得到聚邻氨基苯酚-石墨烯纳米复合物膜。