[发明专利]斑马鱼卵黄原蛋白间接竞争ELISA试剂盒及其检测方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于环境检测领域，具体涉及一种斑马鱼卵黄原蛋白间接竞争ELISA试剂盒及其检测方法与应用。

背景技术

随着我国工业化程度和人民群众生活水平的不断提高，大量的工业废水和生活污水排入到江河湖海中，造成了严重的水环境污染，不仅危害了野生生物的生存，也严重威胁我国人民的健康。虽然这些污染物在环境中的浓度很低，但是能够干扰人和动物体内激素的合成、释放、运输、代谢，以及激素与受体的结合、功能的表达等一系列生物过程，从而扰乱人和动物内分泌系统、神经系统和免疫系统的机能，甚至对生物后代的生殖功能造成潜在影响，这一类化学物质统称为内分泌扰乱化学物质。其中，环境雌激素对野生动物和人类生殖系统的影响受到了广泛关注，已成为继臭氧层、气候变暖之后的第三大环境问题。环境雌激素种类繁多，包括多氯联苯类、二恶英类、农药类、双酚类、金属化合类、类固醇类等，其中塑化剂、杀虫剂、避孕药等被人们广泛利用，它们的雌激素效应已引起了人们越来越多的关注。近年来，关于环境雌激素污染的报道越来越多。早在1985年，人们就在英国城市污水处理厂下游河流中捕获到了具有雌雄两性特征的斜齿鳊鱼，我国武汉市东湖部分鱼类出现了“雄鱼雌化”现象，并且在长江、太湖、珠三角河流中都检测到了雌激素类物质。环境雌激素除了造成鱼虾生长速度减慢、畸形等现象外，还能够通过生物浓缩、生物积累和生物放大等途径增大浓度，对生物和人类造成更大危害。因此，为了减少环境雌激素的危害，有必要建立化学物质的环境雌激素活性筛选体系，制备能够快速检测雌激素活性的试剂盒。

美国、欧盟和日本相继建立起以鱼类为模式生物的环境雌激素筛选评价体系，其中卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vtg)作为重要的生物筛选指标，已经得到广泛应用。鱼类卵黄原蛋白是卵黄蛋白的前体，是一种大分子量的脂磷聚糖蛋白。通常，卵黄原蛋白只能在卵黄形成期的雌鱼体内检测到，但是雄鱼和幼鱼体内也含有卵黄原蛋白基因，在环境雌激素的诱导下，也能合成和分泌卵黄原蛋白。因此，卵黄原蛋白是环境雌激素筛选的特异性生物标志物，通过检测雄鱼体内卵黄原蛋白水平可以评价环境化合物的雌激素活性。

斑马鱼(Danio reeio)，属于辐鳍亚纲(Actinopterygii)鲤科(Cyprinidae)短担尼鱼属(Danio)的一种硬骨鱼，具备以下独特优点：(1)价格便宜，容易获得，并且易于管理；(2)体型小，在较小空间内就可饲养大量斑马鱼(2L的烧杯中就可饲养10条左右)，便于毒理学试验得到较大样本量(3)斑马鱼对内分泌干扰物反应敏感，内分泌干扰物结构多样，种类众多，并且新的内分泌干扰物不断出现，研究表明斑马鱼可以作为评价内分泌干扰物的一个模型；(4)斑马鱼的雌雄鱼在体形上较易分辨。雌鱼体型通常较大，腹部较鼓胀；雄鱼体型稍小，腹部平坦。仔细对照可以看出雌鱼臀鳍的条纹是蓝白相间的，而雄鱼臀鳍是蓝纹间夹着深黄色的条纹。目前，斑马鱼已成为一些生态毒理标准(如OECD和ISO标准)的推荐测试物种，被广泛地应用于环境毒性试验、环境危险度评价、环境污染物生物累积效应的研究中。

研究表明，环境激素暴露可导致雄性斑马鱼卵黄原蛋白生成、发育迟缓、雌性化、雌雄同体、产卵量减少、受精率降低以及性比失衡等变化，其中卵黄原蛋白可能是最敏感的指标。卵黄原蛋白的测定通常采用免疫学方法，其分离纯化是制备抗体、定性定量检测鱼类卵黄原蛋白的基础。研究者多通过17β-雌二醇(17β-estradiol,E₂)腹腔注射的方法诱导卵黄原蛋白的产生，而斑马鱼体型小，注射困难，血液量少，取血困难，无法获得足够的血浆用于卵黄原蛋白的纯化，这大大制约了斑马鱼卵黄原蛋白抗体的制备。

目前，研究者对斑马鱼卵黄原蛋白的定性或定量检测多采用鲤鱼卵黄原蛋白抗体，由于卵黄原蛋白的蛋白质一级结构存在差异，且空间结构也会制约抗原的免疫原性，Watts等(2002)认为大量的转译后修饰会影响鱼类卵黄原蛋白的三级结构，改变抗原决定簇的暴露情况，从而影响不同鱼种卵黄原蛋白之间的种间交叉反应敏感性，使得鱼类卵黄原蛋白抗体在用于其它鱼类卵黄原蛋白检测时受到限制。因此，为了准确反映环境雌激素的存在水平，对不同各类的鱼类，需要制备其相应的卵黄原蛋白抗体。斑马鱼卵黄原蛋白纯品已有国外公司出售，价格为1500元(5μg)，过于昂贵，并且如此小的剂量无法达到抗体制备要求。可见，建立斑马鱼卵黄原蛋白的纯化方法，将成为制备抗体与建立斑马鱼卵黄原蛋白检测的重要前提。