[发明专利]斑马鱼卵黄原蛋白间接竞争ELISA试剂盒及其检测方法与应用

权利要求书

1.一种检测斑马鱼卵黄原蛋白的间接竞争ELISA试剂盒，包括一个盒体，盒体内有空白96孔酶标板1块，封闭液、包被液、洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗各1支，

其特征在于该盒体还装有：斑马鱼卵黄脂磷蛋白纯品1支，兔抗斑马鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支。

2.根据权利要求1所述的检测斑马鱼卵黄原蛋白的夹心ELISA试剂盒，其特征在于所述的斑马鱼卵黄脂磷蛋白制备方法如下：将斑马鱼卵巢取出后称重，加入3倍体积4℃预冷的PBS缓冲液(内含1mM PMSF，pH 7.4)混合，在冰浴条件下用玻璃匀浆器匀浆，8000g离心10分钟，收集上清液；将上清液进行离子交换层析(DEAE-Sepharose Fast Flow)，用分别含0.07M、0.1M、0.2M和1.0M NaCl的25mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)进行不连续洗脱。收集0.2M洗脱组分，装入截留分子量为100kDa的Millipore超滤离心管，4℃、3000g离心30分钟，加入1ml PBS缓冲液，收集截留在超滤离心管膜上的溶液；取1ml收集液加入Sephadex G-200层析柱，用25mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)洗脱，收集第一个主洗脱峰，即为斑马鱼卵黄脂磷蛋白。

3.根据权利要求1所述的检测斑马鱼卵黄原蛋白的夹心ELISA试剂盒，其特征在于所述的兔抗斑马鱼卵黄原蛋白多克隆抗体的制备方法如下：

(1)斑马鱼卵黄原蛋白纯品的制备：采用水体暴露17β-雌二醇的方式诱导斑马鱼产生卵黄原蛋白，将斑马鱼置于2L的玻璃缸中，每缸放入10尾斑马鱼，17β-雌二醇的暴露浓度为200μg/L，每天全部换水，并重新加入相应的17β-雌二醇，早晚投喂饲料，水温26℃；7天后将斑马鱼放入50％的酒精中，待斑马鱼麻醉后，取出称重，并加入3倍体积4℃预冷的PBS缓冲液(内含1mM PMSF，pH 7.5)，在冰浴条件下用玻璃匀浆器匀浆，4℃、8000g离心10分钟，收集上清液；利用权利要求2的方法从上清液中纯化获得斑马鱼卵黄原蛋白；

(2)兔抗斑马鱼卵黄原蛋白多克隆抗体的制备：取600μg纯化的斑马鱼卵黄原蛋白，加入等体积的弗氏完全佐剂，充分乳化后对新西兰大白兔进行背部皮下多点注射，每点注射0.1ml，两周后再次加强免疫，免疫剂量为600μg/只，用弗氏不完全佐剂充分乳化后进行背部皮下注射，此后，每隔10天按以上方法进行加强免疫；第5次注射后于第5天从心脏取血，6000r/min离心20分钟，收集上清，获得了兔抗斑马鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清；抗体的纯化分为以下几步，上样前向多克隆抗血清中加入1/3的对照阴性样品(雄鱼匀浆液)，低温振荡2h，4℃过夜，次日离心取上清；向上清中加入等体积的PBS缓冲液；在冰浴条件下加入等体积饱和硫酸铵，0℃震荡2h后，低温离心(8000rpm,15min)，弃上清，沉淀用10ml PBS缓冲液溶解；用0.45微米孔径的滤膜过滤后，上Hitrap Protein G柱，以PBS缓冲液洗脱10个柱体积后，用0.1M甘氨酸(pH 2.7)洗脱，即获得兔抗斑马鱼卵黄原蛋白多克隆抗体。

4.权利要求1所述的检测斑马鱼卵黄原蛋白的间接竞争ELISA试剂盒在环境雌激素类物质筛选与内分泌扰乱化学物质研究中的应用。

5.利用权利要求1所述的试剂盒进行内分泌扰乱化学物质检测的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)用包被液稀释试剂盒中的斑马鱼卵黄脂磷蛋白纯品至400ng/L，在空白96孔酶标板中加入100μl/孔，4℃包被过夜。弃去孔内溶液，洗涤3次。

2)在96孔酶标板中加入封闭液，300μL/孔，室温下孵育1小时。弃去孔内溶液，洗涤3次。

3)在96孔酶标板中加入用样品稀释液稀释了的斑马鱼卵黄脂磷蛋白标准品、待测样品50μL/孔，并在每孔加入50μL用样品稀释液1:5000倍稀释的兔抗斑马鱼卵黄原蛋白抗体，37℃下孵育2小时。弃去孔内溶液，洗涤5次。

4)在96孔酶标板中加入用样品稀释液1:2000倍稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗，100μL/孔，室温孵育1小时。弃去孔内溶液，洗涤5次。

5)在96孔酶标板中加入新鲜配制的显色液，100μL/孔，于室温暗处37℃反应10min。

6)待呈现明显的黄色后加终止剂，50μL/孔。

7)用酶标仪测定450nm波长下各孔的吸光值，测定应在加终止液后15分钟以内进行。

8)计算：以标准品浓度的对数值为横坐标，吸光率为纵坐标，绘制出标准曲线。吸光率公式为：B_i/B₀(％)＝(OD-NSB)/(OD₀-NSB)×100。B_i为标准品或样品OD值，B₀为标准品0的OD值，NSB为非特异性结合的OD值。本实验中NSB为测定PBS包被的OD值。根据样品的OD值计算其吸光率，由标准曲线计算出相应的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。