[发明专利]一种基于琼枝麒麟菜的细胞杂交栽培方法

权利要求书

1.一种基于琼枝麒麟菜的细胞杂交栽培方法，其特征在于，其步骤如下：

1)、原生质体的分离

选取野生种和人工养殖种琼枝麒麟菜的新鲜藻体，经消毒灭菌处理后加入混合酶液，在光照≤500lux和温度20-25℃的条件下，酶解1.5～2h，获得两种琼枝麒麟菜的原生质体；所述混合酶液是指在酶液中含有2％的果胶酶、3.5％的鲍鱼消化道粗提酶和5mmol/L葡萄糖酸钠，pH为6.5；

2)、原生质体的融合

将分离得到的原生质体，洗涤液洗涤干净，用f/2培养液分别制成原生质体浓度为10⁴～10⁵个/mL的原生质体悬液，再加入CaCl₂.H₂O₂、Mg Cl₂.H₂O₂，使其浓度分别为5mmol/L；然后将两种原生质体悬浮液按1:1比例混合，加入PEG诱导两种原生质体融合；

3)、杂种细胞的选择

将含融合细胞的原生质体悬液加到培养皿中，40℃保温，加入含0.8％琼脂糖的f/2培养液充分混匀，然后室温冷却凝固；显微镜下识别融合细胞，并做好标记；

4)、杂合细胞的培养

挑取单个已融合的细胞，用杂合培养液进行培养，直至融合细胞开始分裂并形成2.5～3cm细胞团；所述杂合培养液是以f/2培养液为基础培养液，并添加2,4-D 0.5μg/L、6-BA 0.25μg/L、琼胶0.5％；

5)、杂合细胞诱导再生植株

将形成的细胞团移入诱导培养液中通气培养，诱导细胞团生成新的植株；所述诱导培养液是以f/2培养液为基础培养液，并添加6-BA 0.25μg/L、IBA0.1μg/L。

2.根据权利要求1所述的基于琼枝麒麟菜的细胞杂交栽培方法，其特征在于：所述鲍鱼消化道粗提酶是取新鲜鲍鱼消化道组织，重蒸水清洗干净，冷冻干燥，研钵中研磨成细粉，过60目筛，然后按5mL/g的加入量加入事先冷冻的0.05mol/L磷酸缓冲液，超声波辅助提取20min,最后，低温离心10min取上清液，即为鲍鱼消化道粗提酶液。

3.根据权利要求1所述的基于琼枝麒麟菜的细胞杂交栽培方法，其特征在于：所述的诱导原生质体融合是在混合原生质体悬浮液中加入PEG5000，使其浓度达到30％，处理时间为15min，处理温度25～28℃，光照条件为≤500lux。