[发明专利]一种高效率、高转化率生产1,3‑丙二醇的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，是关于一种通过克雷伯氏肺炎杆菌，并适度强化克雷伯氏肺炎杆菌的3-羟基丙酸代谢途径高效率、高转化率生产1,3-丙二醇的方法。

背景技术

1,3-丙二醇(1,3-porpanediol，简称1,3-PD)是一种重要的化工原料，可用作溶剂、抗冻剂或保护剂、精细化工原料以及新型聚醋——聚对苯二甲酸丙二醇醋(PTT)和聚氨醋的单体。PTT已被证明是一种性能优异的新型聚酯材料。目前1,3-PD生产主要采用生物合成。生物合成法的主要路线是在微生物的作用下将甘油转化为1,3-PD。目前，自然界中能将甘油转化为1,3-PD的微生物大致包括：克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiela pneumoniae)、弗氏柠檬菌(Citrobacter freundi)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)等。

研究表明克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-PD的能力最强，国内也有一些相关的生产菌种专利，如：1、周胜等，一种红树林克雷伯氏菌及其在生产1,3-丙二醇中的应用(授权号：CN102604863)；2、刘德华等，一株高产1,3-丙二醇的微生物(公开号：CN103740609A)。但是缺少高转化率高效率的生产菌种依然是制约1,3-PD产业化的主要障碍。

克雷伯氏肺炎杆菌中，1,3-PD在的生物合成代谢途径研究表明：①其甘油第一个氧化与还原途径与分配节点具有刚性，这种刚性调节很大程度上和菌种的本身的特性有关；②还原途径上的中间产物3-羟基丙醛的积累是影响1,3-PD的重要因数。

目前也有一些解除中间产物3-羟基丙醛积累的研究，如：①过表达 1,3-PD氧化还原酶；②过表达3-羟基丙醛脱氢酶等。但是过表达1,3-氧化还原酶对1,3-PD的生产促进作用很小，过表达3-醛基丙醛脱氢酶又会造成3-羟基丙酸(3-HP)的积累，这样很难获高的1,3-PD产量。

发明内容

本申请的发明人在研究中通过选育，获得了一株高产1,3-PD的克雷伯氏肺炎杆菌Klebsiela pneumoniae KG。Klebsiela pneumoniae KG于2014年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市洪山区八一路，武汉大学，中国典型培养物保藏中心邮政编码：430072)，保藏号CCTCC M2014574。该克雷伯氏肺炎杆菌用于转化甘油生产1,3-丙二醇时相比其他的克雷伯氏菌具有更高的转化效率。进一步适度强化克雷伯氏肺炎杆菌的3-HP代谢途径，适度强化3-HP代谢途径既解决了3-羟基丙醛的积累又避免了过多副产物3-HP的抑制，克服了以往过度表达的缺点。

本发明的转化甘油生产1,3-丙二醇的方法，包括种子培养以及发酵罐发酵转化甘油生成1,3-丙二醇，该方法通过克雷伯氏肺炎杆菌CCTCC M2014574，并在克雷伯氏肺炎杆菌中适度强化表达3-羟基丙醛脱氢酶，实现了高效率、高转化率生产1,3-PD。

根据本发明，所述适度强化表达是通过Tac启动子的渗漏表达实现的。

根据本发明，所述的3-羟基丙醛脱氢酶基因可以来源于克雷伯氏肺炎杆菌，大肠杆菌。

相比现有的转化甘油生产1,3-PD的方法，本发明的方法的主要优点包括：产物浓度高，生产强度大，转化率高。

附图说明

图1:KG菌株的16srDNA的同源性分析

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。应理解，以下实 施例仅用于说明本发明，而非用于限定本发明的范围。

实例中：

LB培养基为：

0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，1％NaCl，pH 7.0；固体培养基在此基础上加入1.2％-1.5％的琼脂。

斜面培养基为：

K₂HPO₄3H₂O 7g/L，(NH₄)₂SO₄1g/L，KH₂PO₄2g/L，MgCl₂ 7H₂O 0.1g/L，酵母膏7g/L，微量元素各0.3mL，调整pH 7.0，琼脂2g/L。

种子培养基为：