[发明专利]一种用于单细胞定量分析的微流控连续进样方法及装置

说明书

技术领域：

本发明属于单细胞分析技术领域，涉及一种可以提供微流控芯片上“细胞上样、单细胞捕获/装载、单细胞溶膜和胞内组分电泳分离”等操作的进样方法和装置，尤其涉及一种用于单细胞定量分析的微流控连续进样方法和装置。

背景技术：

单细胞定量分析是一类在单个细胞尺度上实现单细胞进样、多参数测量和胞内组分信息定量获取的全新实验技术。该技术的发展与完善，不仅可以在单细胞层面、分子水平上为生命科学、医药健康等学科的分析和研究提供重要的技术支撑，而且可以为生命奥妙的诠释以及疾病机制与诊疗手段的探索提供全新的信息，从根本上推动疾病早期诊断、新药创制等相关领域的跨越式发展。

单细胞进样作为单细胞定量分析不可或缺的关键步骤,其作用是从群体细胞中精确捕获单个目标细胞，将其受控装载/送入分离通道或预定位点，并完成观测、溶膜、电泳分离等操作。良好的进样方法除了包括对分析结果重要影响的因素如超小体积(单细胞)样品的获取与进样体积的可控、连续进样与较高通量等特征外，进样方法的简单、可重复、易于其他操作集成等特征不能忽视。

受细胞尺度小、受试进样体积下降、检测精度和分析速度提升等条件的限制，目前用于单细胞分析研究的进样操作还高度依赖于传统的生命化学分析手段和操作者的细致程度。例如显微镜下的微管吸吮、光镊、磁镊、膜片钳及流式细胞术等。这些操作虽然可行，但是缺点明显：(1)大量的操作都是在开放环境中进行，操作过程时间长，极难进行样品污染的控制，而对于单细胞定量分析而言，由于样品量极少，极其微量的污染将导致严重的结果错误；(2)大多数操作存在细胞样品与试剂操作的不平行现象，不仅减缓了实验进度，而且很难保证单细胞进样与样品进样体积的操控精度；(3)大量的耗时操作，不仅导致实验通量无法上升，同时还导致很多对操作时间要求较高的实验无法实现；(4)尽管流式细胞术能对完整的细胞进行快速检测和分类，但由于不能对单细胞内的组分进行电泳分离，难以得到精确的定量信息；(5)常规的实验器具不仅需要较大的受试细胞样本，而且很难适合干细胞、元祖细胞等珍稀样本，导致较高的空载率以及假阳性与假阴性结果的较大系统误差，使得精细的定量结果掩盖在设备带来的噪音中。

微流控技术作为近年来能够精确操控微尺度生化流体的一种新兴手段，其微米级的通道尺度与细胞直径具有良好的相符性，为实现单细胞的操纵和微环境调控提供了极为便捷的条件，因而该技术已成为单细胞进样与定量分析研究的重要手段。微流控单细胞进样通常包括微流控芯片上的“细胞上样、单细胞捕获/装载、单细胞溶膜及电泳分离”等多步复杂操作。迄今为止，微流控单细胞进样按进样策略可以分为：(1)阀控泵进样(Science.2007,315,81-84.)；(2)电动进样,主要模式有简单进样(J.Chromatogr.A,2005,1063,227–233.)、夹流进样(J.Chromatogr.A.2009,1216,6746–6751.)和门式进样(Lab Chip,2011,11,1144–1150.)；(3)负压进样(Lab Chip,2010,10,1472–1475.)；(4)压力结合电动的进样(Electrophoresis 2010,31,1630–1636.)。阀控泵进样需要机械微泵驱动细胞流体，外部气泵与芯片上多个微阀的联动来控制单细胞的捕获和溶膜。这类方法的不足为：所用芯片加工复杂，方法实施高度依赖于复杂操作，并不适合大规模的商业化使用。电动进样通过切换施加到芯片液池上的电压，可以在简单“十字”或双“T”结构芯片上完成细胞上样、单个细胞的捕获、溶膜及电泳分离。这类方法简便灵活、易于与芯片耦合和整个仪器系统的小型化；但是电动进样也存在样品歧视效应，同时过高的电压(电场强度)会造成细胞样品的不可逆损伤。负压进样利用施加到“十”字芯片样品废液端(SW)和缓冲液废液端(BW)的负压，实现细胞上样和单细胞装载。该类方法可以在一定程度上解决电动进样中样品歧视效应的问题，但其控制进样体积的能力有限，方法实施依赖于多个仪器设备的联动和多步复杂操作；同时该方法也存在一个难以解决的矛盾，即如果采用玻璃基质芯片有利于电泳分离，但与气动器件耦合困难，而采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)弹性体芯片有利于与气动器件的耦合，但电泳分离困难。压力结合电动的进样则是利用施加到“十”字芯片样品废液端(SW)上的负压或静压力，实现细胞上样，然后撤销负压或静压力，在分离通道两边施加一个电场，并借助显微镜观察实现单细胞的捕获与装载。该类方法无样品歧视效应，对细胞无损伤。但是该方法实施依赖于人工的多步操作，同时由于其静压力采用传统贮液池(即贮液池的高度大于其内径)，贮液池的液面随着流体的流出而下降，使得流速随液面下降而明显减少，难以适应进样体积精确调控和较长时间的连续进样操作。总体而言，现有的微流控单细胞进样方法仍存在以下共性问题：(1)难以实现连续进样。目前的进样方法在完成一次进样及分析后，通常需要中断分析过程，然后进行流体操控手段及样品、试剂的移出，清洗芯片，新样品、试剂注入，操控手段重新施加等大量的耗时操作，导致系统的分析通量无法上升。(2)进样效率低。目前进样的操控手段多是采用多个独立仪器设备的简单组合，且单个细胞的捕获往往需要借助显微镜，使得样品、试剂的操作难以平行或同步，不仅导致进样体积可控性差，还影响分析系统的稳定性。