[发明专利]硫酸酯化绞股蓝多糖的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种绞股蓝多糖的制备方法，特别是涉及一种硫酸酯化绞股蓝多糖的制备方法。

背景技术

绞股蓝又称天堂草、超人参、公罗锅底、遍地生根、七叶胆和七叶参等，是陕西特色天然资源，为葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物，属于药食同源的植物。性寒、味甘，有益气，安神，降血压之功效，民间称其为“神奇”的“不老长寿药草”，“星火计划”中将其列为“名贵中药材”之首。绞股蓝主要有效成分为多糖类、黄酮类、皂苷类及微量元素类，其功效主要是促进人体脂肪类物质代谢、营养人体细胞，同时具有不错的解毒消炎作用，广泛应用于高血脂、脂肪肝、肥胖、便秘、失眠、乙肝、慢性呼吸道炎症(咽喉炎、肠胃炎等)的治疗与保健。

多糖是由许多相同或不同的单糖以α-或β-糖苷键组成的化合物，普遍存在于自然界植物体中，包括淀粉、纤维素、多聚糖、果胶等。目前认为多糖是绞股蓝植物中最重要的化学活性成分，具有调节免疫功能、抑制肿瘤、抗氧化、降血糖、抗疲劳、保护肝损伤、保护神经细胞谷氨酸氧化性损伤等生物活性。已经被广泛运用于化妆品、食品行业。

分子修饰对多糖生物活性有非常重要的影响，通过分子修饰可使原多糖活性提高，或产生新的活性。目前最常用的修饰手段主要采用化学的方法引入其它基团，改变多糖的结构。硫酸化修饰即是多糖分子修饰中最为重要和常见的一种修饰方法。硫酸化修饰是将多糖分子的羟基末端、羧基末端或者氨基末端用硫酸基团取代，以便得到活性优于原多糖分子的硫酸化多糖分子。分子量和单糖残基硫酸根取代度是最重要的2项指标。许多多糖经硫酸化修饰后，其免疫活性显著增强，主要体现在对脾淋巴细胞和巨噬细胞的增殖、刺激细胞因子的分泌等方面，并且其免疫活性大小受取代度的影响。硫酸化修饰可潜在地作为提高多糖免疫活性的有效途径之一。

最常用的硫酸酯化试剂是氯磺酸-吡啶复合物，因为其产率和取代度均较为理想，易于得到硫酸化多糖。

文献“授权公告号是CN101948549B中国发明专利”公开了一种硫酸化绞股蓝多糖制备方法。该方法采用氯磺酸和吡啶作硫酸化试剂，分别以反应温度，反应时间，反应物配比作为影响因素，采用三因素三水平的方法得到9个不同取代度的硫酸酯化绞股蓝多糖，简单说明了其对免疫机能的发挥程度。整个过程反应转化率较高，但是由于氯磺酸本身具有强氧化性和刺激性，实际实验操作过程较为繁琐，反应危险度高；更为重要的一点是，该方法并未针对不同取代度进行免疫活性分析实验，即最终并未解决取代度与免疫活性之间的关系。

发明内容

为了克服现有方法制备的硫酸酯化绞股蓝多糖免疫活性低的不足，本发明提供一种硫酸酯化绞股蓝多糖的制备方法。该方法采用三氧化硫-吡啶作为硫酸酯化试剂，DMF做为反应溶剂，分别以反应温度，反应时间，反应物配比作为影响因素，采用三因素三水平的方法制备得到绞股蓝多糖产品，采用氯化钡-明胶浊度法测其各自的取代度。分别取小鼠原代脾脏淋巴细胞和腹膜巨噬细胞，采用MTT法检测不同取代度的；硫酸酯化绞股蓝多糖产品对细胞增殖的影响。通过本发明实现了制备过程简单可控，安全性高，并且可以针对性地制备具有较高免疫活性的硫酸酯化绞股蓝多糖产品。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种硫酸酯化绞股蓝多糖的制备方法，其特点是采用以下步骤：

步骤一、在大容器内用95％乙醇浸泡绞股蓝干植物，之后除去乙醇，在旋转蒸发仪上用95％乙醇50℃回流提取2次，每次2h，提取结束后过滤，挥干乙醇，得到的干燥物加超纯水，在大的双口烧瓶中95℃回流提取3次，每次3-4小时，结束后用双层纱布过滤，收集滤液，50℃减压浓缩，20℃，7000rpm，离心30min后，取上清液，加入4倍体积95％乙醇，4℃沉淀过夜，收集沉淀，离心。沉淀分别用95％乙醇、丙酮、乙醚洗涤，最后冷冻干燥，得到绞股蓝粗多糖粉末。

步骤二、将0.5％的绞股蓝粗多糖水溶液用30％浓氨水调节pH值至8.0，在搅拌下,于50℃逐渐加入30％H₂O₂，至溶液为淡黄色，恒温保持2h，用CH₃COOH调节pH值至7.0，减压浓缩。加入4倍上清体积的95％乙醇，4℃过夜，7000rpm，15min离心，收集沉淀，依次用95％乙醇、丙酮、乙醚洗涤，冷冻干燥。得到精制多糖，命名为GPMP。