[发明专利]一种可降解孔雀石绿的过氧化物酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及过氧化物酶，尤其是涉及一种可降解孔雀石绿的过氧化物酶及其制备方法。

背景技术

孔雀石绿(Malachite Green,MG)是一类三苯基甲烷类化合物，作为抗菌药物和染料被广泛应用于水产养殖业、造纸业、纺织业和皮革业。但近年来的研究发现，孔雀石绿对哺乳动物细胞有极强的致癌性和致畸变性(Fessard et al.1999；Srivastava et al.2004)。然而由于孔雀石绿在拮抗水产病原菌方面的有效性及低成本使其仍被使用，因此对近海生态环境造成了一定程度的污染。

过氧化物酶(Peroxidase,EC 1.11.1)是一类以过氧化氢及有机过氧化物为底物的氧化酶类，可以清除由于细胞呼吸作用而产生的活性氧基团从而起到保护细胞的作用(Thomas et al.1980)。同时，过氧化物酶也与工业染料等大分子物质降解相关。Anirban等发现，辣根过氧化物酶可以降解多种工业染料(Anirban et al.2001)，同时Ramesh等和Liaquat等均发现一些微生物和动物来源的过氧化物酶对大分子物质有着降解的作用(Anirban et al.2001；Ramesh et al.2013；Liaquat et al.2013)。专利方面，不同来源的过氧化物酶被分离、纯化，应用于定量、显色和化学修饰等领域，但海洋细菌来源的过氧化物酶应用于孔雀石绿降解及环境修复上尚属首次。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种嗜中温黏着杆菌(Tenacibaculum mesophilum)HMG1。

本发明的第二目的是提供一种海洋沉积物来源的过氧化酶基因。

本发明的第三目的是提供一种由所述过氧化酶基因编码的过氧化物酶。

本发明的第四目的是提供所述过氧化物酶的制备方法。

本发明的第五目的是提供所述过氧化物酶在制备孔雀石绿降解剂中的应用。

所述嗜中温黏着杆菌(Tenacibaculum mesophilum)HMG1，已于2014年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.9835，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。所述嗜中温黏着杆菌(Tenacibaculum mesophilum)HMG1是一种过氧化物酶的生产菌株。

所述过氧化物酶基因的序列(SEQ ID No.1)如下：

SEQ ID No.1的信息：

1)名称：Tenacibaculum mesophilum HMG1过氧化物酶基因；

2)分子类型：DNA；

3)序列特征：

A)长度：2283bp；

B)类型：核酸；

C)链性：双链；

D)拓扑结构：线性。

所述过氧化物酶基因编码的过氧化物酶的氨基酸序列(SEQ ID No.2)如下：

SEQ ID No.2的信息：

1)名称：Tenacibaculum mesophilum HMG1过氧化物酶；

2)分子类型：蛋白质；

3)序列特征：

A)长度：760aa；

B)类型：氨基酸。

所述过氧化氢酶的制备方法包括以下步骤：

1)克隆所述过氧化物酶基因peroxidase；

2)将所述过氧化物酶基因插入表达载体，构建携带所述氧化物酶基因的重组表达载体；

3)将所述重组表达载体转化到E.coli BL21(DE3)中；

4)选取转化后E.coli BL21(DE3)中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养；

5)离心收集发酵后的E.coli BL21(DE3)细胞，重悬所述E.coli BL21(DE3)细胞于裂解缓冲液中进行裂解；

6)将步骤5)中裂解后的悬液进行离心，收集上清液；

7)将上清液与预先与NiSO₄结合的R10-Flammable(购自GE Healthcare)混匀，用浓度梯度咪唑(20mM，80mM，200mM)进行洗脱，即得所述过氧化氢酶。