[发明专利]一种采用超滤法辅助双水相萃取技术提取乳过氧化物酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取乳过氧化物酶的方法，特别涉及一种采用超滤法辅助双水相萃取技术提取乳过氧化物酶的方法。本发明属于乳过氧化物酶的提取制备技术领域。

背景技术

乳过氧化物酶(LP)是存在于动物乳中的一种天然抗菌物质，在有过氧化氢存在的条件下，乳过氧化物酶能够催化硫氰酸盐形成抗菌介质，LP的生物学意义是参与自然宿主抵御对微生物的入侵，对动物哺乳期的乳腺和新生婴儿的肠道病原微生物起到保护作用，LP是由一个包含612个氨基酸的单一多肽链组成，分子量约为85kDa，等电点为8.0-8.5，在牛乳中的含量为10-30mg/mL，在文献中已经证明了LP是食品中存在的天然防腐剂并且是安全的。

乳过氧化物酶体系在食品行业中应用最广泛的是乳制品，在过去几十年里，国内外学者报道了从原料乳中提取LP的方法，有色谱技术、膜色谱等。色谱技术主要包括离子交换、分子筛、免疫亲和色谱等，膜色谱应用较多的是离子交换吸附膜。虽然传统这些色谱法提取LP纯度较高，但是仍有很多缺点，例如耗时较长，回收率较低及成本昂贵，并不适宜大量生产乳过氧化物酶。想要高效率的从牛乳清中提取LP并不是一个简单的任务，因为乳清中存在大量的杂蛋白，给分离带来了困难，因此迫切的需要一个效率高、成本低、开发潜力大的从乳清中分离LP的方法。

与一些传统的分离方法相比，双水相萃取技术所使用的分离设备简单、条件温和、操作简单，且其获得产品的回收率和纯度较高。目前，双水相萃取技术已广泛地应用于蛋白质、酶、核酸等生物产品的分离和纯化，以及药物有效成分的提取，并逐步向工业化生产迈进。双水相萃取体系是由两种聚合物或是一种聚合物和一种盐组成的，其原理是依据物质在两相间的选择性分配，当物质进入双水相体系后，由于生物分子量大小、电荷作用和各种力(如疏水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响作用，使其在上相和下相中的浓度不同。对于某一物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件，就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化之目的。它为生物分子提供生物兼容的环境，具有连续操作空间，易于扩大生产的优点，并且对环境无害。国内研究报道了利用双水相法提取脂肪酶、糖化酶、淀粉酶等工艺方法，但是目前还没有应用双水相法提取乳过氧化物酶的报道。本发明利用双水相技术并结合超滤方法，建立了快速、高效率、低成本的乳过氧化物酶分离提取技术，能够满足工业化大规模生产的要求。

超滤膜分离技术具有能耗低、分离过程中物质不发生相变、分离效果好、操作简便、无副作用、无二次污染、分离产物易于回收等优点，已被广泛应用于工业生产中的产品分离、纯化等。将膜分离技术应用于乳过氧化物酶纯化处理，为充分开发利用乳过氧化物酶提供了一种行之有效的方法。因此本发明采用超滤膜分离技术，进一步纯化双水相萃取得到乳过氧化物酶，为工业化生产乳过氧化物酶提供了科学依据。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术缺陷，提供一种可以用于工业化生产高回收率和高纯化倍数的，且可用于食品工业的乳过氧化物酶的提取方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

以牛乳清为原料，以双水相萃取技术为提取手段，确定双水相萃取技术中最佳盐相和聚合物的选择以及其各自最佳用量、体系pH的工艺条件，并用超滤技术进行进一步纯化，最后透析脱盐和冷冻干燥制得成品，即原料乳清→双水相提取乳过氧化酶→收集富集乳过氧化物酶的盐相溶液→盐相溶液使用超滤分离→离心后收集截留溶液→透析脱盐→冷冻干燥→乳过氧化物酶粗产品。

具体的，本发明的一种采用超滤法辅助双水相萃取技术提取乳过氧化物酶的方法，其特征包含以下步骤：

(1)双水相萃取乳过氧化物酶：

除去新鲜的牛乳中的脂肪和酪蛋白后得到乳清，在室温条件下，直接向乳清中连续添加聚乙二醇(PEG)和盐并将其置于搅拌器上不断搅拌，直至聚乙二醇和盐完全溶解于乳清中，其中聚乙二醇的分子量为6000Da，盐为MgSO₄，聚乙二醇的终浓度为12-16％(w/w)和MgSO₄的终浓度为10％-14％(w/w)，使用NaOH调节体系pH至8.0-9.0，静止，待两相完全分离，收集体系的下相，即盐相部分；

(2)超滤：

将收集的盐相溶液，使用HCl调节pH至6.5-7.5，用超滤膜进行超滤分离，以除去杂蛋白，收集截留溶液，进而达到浓缩纯化乳过氧化物酶的目的；

(3)脱盐处理：

将步骤(2)收集的截留溶液装入透析袋内进行脱盐；

(4)干燥：