[发明专利]一种耐高糖耐碱的β-葡萄糖苷酶的表达及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种β-葡萄糖苷酶，它能够被葡萄糖显著提高酶活，能够在碱性条件下保持优良的稳定性。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21)，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，是一种外切水解酶类。它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，广泛的应用在食品风味物质的释放、纤维素降解和日用化工业中。这些应用中，葡萄糖常常是水解产物之一，但是葡萄糖也是大部分β-葡萄糖苷酶的抑制剂。因此，挖掘高葡萄糖耐受性的β-葡萄糖苷酶一直是研究的热点。

目前的文献报道中一共有约四十多个微生物来源的β-葡萄糖苷酶具有不同程度的葡萄糖耐受性。葡萄糖达到1.0mol/L以上，酶活依然可以不受到抑制的β-葡萄糖苷酶仅有3个，分别来自BacillushaloduransC-125(Xuetal.CurrMicrobiol2011，62：833-839)和2个不同的宏基因组文库(Uchiyamaetal.JBiolChem2013，288：18325-18334；Biveretal.JIndMicrobiolBiotechnol2014，41：479-488)。但是Uchiyama报道的β-葡萄糖苷酶同时具有高效的转糖苷活性，该酶的高葡萄糖耐受性是由于葡萄糖可以被转化成其它产物。我国专利中有7篇公布了能耐受葡萄糖的β-葡萄糖苷酶及突变体，但是没有能在1.0mol/L葡萄糖存在时酶活依然不受影响的。

黄热厌氧芽孢杆菌云南亚种(Anoxybacillusflavithermussubsp.yunnanensis)是本实验室分离鉴定的新亚种(Daietal.FEMSMicrobiolLett2011，320：72-78)。从菌株E13^T和PGDY12中分别克隆获得了β-葡萄糖苷酶基因。这两个酶的氨基酸序列相似性为98.4％。与已经有文献报道的β-葡萄糖苷酶(Brevesetal.ApplEnvironMicrobiol1997，63：3902-3910)最高序列相似性仅为60％。其中菌株E13^T的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列在NCBI的序列号为AGS46809.1。但是，这两个β-葡萄糖苷酶的野生型基因在大肠杆菌中都无法表达出有活性的酶。由于来源菌株E13^T的β-葡萄糖苷酶基因是完全观察不到表达条带，而来源菌株PGDY12的β-葡萄糖苷酶基因是表达出无活性的包涵体，因此选择来源菌株PGDY12的β-葡萄糖苷酶进行了进一步优化研究。

本发明通过优化基因序列和探索诱导表达条件，获得了一个能在大肠杆菌中表达出活性的β-葡萄糖苷酶基因，阐明了活性表达的核心技术要点。该β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性非常好，且没有转糖苷活性。低于1.75mol/L的葡萄糖都能增强酶活，存在2.0mol/L的葡萄糖时，酶活依然保留了76％。酶的碱稳定性也很好，pH9.0和10.0孵育24h后依然保持99％和97％的酶活。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐高糖耐碱的β-葡萄糖苷酶，以弥补现有技术存在的不足之处。

本发明提供了编码所述β-葡萄糖苷酶的基因序列，序列为SEQIDNO：1；该基因序列编码的氨基酸序列为SEQIDNO：2。

本发明提供的β-葡萄糖苷酶氨基酸序列(SEQIDNO：2)是来自黄热厌氧芽孢杆菌云南亚种PDGY12，与在NCBI上面已经公布的黄热厌氧芽孢杆菌云南亚种E13^T中β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列(NCBI序列号AGS46809.1)有7个氨基酸不相同，这二者的序列相似性为98.4％。此外，黄热厌氧芽孢杆菌云南亚种E13^T中β-葡萄糖苷酶未作功能鉴定。

本发明提供的β-葡萄糖苷酶基因(SEQIDNO：1)是依据大肠杆菌密码子偏好性进行了优化，由生物公司合成。该基因序列与黄热厌氧芽孢杆菌云南亚种E13^T中β-葡萄糖苷酶的基因序列相似性仅为74.9％。此外，该β-葡萄糖苷酶的野生的未优化的基因序列在大肠杆菌无法表达出有活性的蛋白。

本发明提供了表达上述β-葡萄糖苷酶的重组质粒，是将基因序列为SEQIDNO：1的核苷酸片段插入到表达载体pET22b中。

本发明提供了携带表达上述β-葡萄糖苷酶的大肠杆菌重组菌。