[发明专利]一种禽呼肠孤病毒培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种禽呼肠孤病毒培养方法。

背景技术

禽呼肠孤病毒(ARV)能够感染鸡或火鸡并引发鸡病毒性关节炎，其具体症状包括关节炎、腱鞘炎、吸收障碍等。该病毒在商品鸡群中普遍存在，主要侵害肉鸡，也感染商品蛋鸡和火鸡，感染率可达90％以上，死亡率为5％～10％。在20世纪80年代中期证实了该病在我国的存在，近年来，鸡病毒性关节炎虽然被控制住，但是仍有发。曾有报道指出，某鸡场20日龄的雏鸡个别会出现关节肿大现象，随着病情的发展，逐渐出现跛、瘫痪、行动不便等现象，经诊断为鸡病毒性关节炎，经统计发病率高达30％，死亡率高达8％，其危害性非常大，给广大养禽户带来了巨大的经济损失。该病毒主要通过呼吸道和消化道传播，也可通过垂直传播，种鸡可通过孵蛋传递病毒，刚孵出的雏鸡最为易感，并迅速发生水平传播。

在免疫接种上，1日龄接种弱毒疫苗可有效地预防感染，但将影响马立克氏病疫苗的免疫效果。一般通过免疫接种灭活全病毒疫苗来控制典型的禽呼肠孤病毒感染。并且种鸡接种高抗原含量的灭活疫苗可使母源抗体对后代提供较好的保护作用，能大大促进了病毒性关节炎的防控工作。目前市场上存在几种常用的预防疫苗，弱毒疫苗占较大份额，主要采用鸡胚或鸡胚成纤维细胞的方式进行病毒增殖，由于鸡胚常携带一些外源病毒，因此在利用鸡胚或鸡胚成纤维细胞制备疫苗时存在外源病毒感染的问题，同时采用鸡胚或鸡胚成纤维细胞的方式存在成本高、工艺复杂、工作量大、批次间不稳定等缺陷。

此外，即便优选得到一种新的、性能更为优异的生产细胞，针对该细胞这种全新的生长环境采用怎样的培养条件能更加有利于病毒的增殖、获得更好的生产效率也是值得深入研究的问题。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种禽呼肠孤病毒培养方法，以解决现有技术中宿主细胞性能不理想，培养条件效率较低的技术问题。

为实现以上技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种禽呼肠孤病毒培养方法，该方法是以vero细胞作为宿主细胞实施的。

优选的，包括以下步骤：

1)在容积为100～500L的反应器中以4×10⁵～6×10⁵个/ml的密度接种宿主细胞悬液进行培养，至细胞密度为2×10⁶～3.5×10⁶个/ml，得到培养液；

2)向步骤1)得到的培养液中接种禽呼肠孤病毒，进行培养；

3)收获病毒。

优选的，步骤1)接种的宿主细胞悬液是通过以下方法制备得到的：利用容积小于14L的反应器接种宿主细胞进行扩增，用细胞消化液对培养得到的培养液进行消化，得到细胞悬液。

优选的，进行消化的培养液中细胞密度不低于5×10⁶个/mL。

优选的，所述细胞消化液配方为：0.25％胰酶、0.53mMEDTA。

优选的，所述细胞消化液pH为7.2～7.6。

优选的，步骤1)的培养方法为搅拌式培养。

优选的，步骤1)培养过程中培养液pH为7.0～7.4。

优选的，步骤2)培养过程中培养液pH为7.2～7.5。

优选的，培养过程中培养液中具有微载体。

优选的，所述微载体的加入量为8～10g/L。

在以上技术方案中，利用vero细胞作为宿主细胞用于禽呼肠孤病毒增殖，其性能优异、更加适于病毒增殖，同时确定了更优的培养工艺，本发明的有益效果包括：

1、细胞培养、病毒复制采用的设备为生物反应器，结合细胞的贴附载体，可实现细胞的悬浮培养，提高单位体积细胞的数量，从而提高病毒的产毒量,同时可对培养过程进行监控及定量控制，保证生产工艺的稳定性。

2、采用本发明培养的鸡病毒性关节炎病毒液病毒含量高，从而制备的灭活疫苗抗原含量高，提高了灭活疫苗的效果。

3、本发明采用的生物反应器微载体增殖病毒的方式，降低了成本，节省了劳动力，增加产品的稳定性。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。