[发明专利]一种促进乳酸乳球菌有氧呼吸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及促兼性厌氧型微生物有氧呼吸领域，具体涉及一种促进乳酸乳球菌有氧呼吸的方法。

背景技术

目前，乳酸乳球菌被广泛应用于发酵乳制品的生产，其在外源基因表达及活菌疫苗制品等方面也具有重要的应用价值。同时，它也是革兰氏阳性菌的模式菌种，具有重要的研究价值。

现有研究表明，乳酸乳球菌属于兼性厌氧菌，胞内缺乏完整的呼吸链，只有当外源血红素存在时，才能使其产能方式由发酵转变为有氧呼吸。在有氧呼吸方式下，乳酸乳球菌产能更多，其生物量和4℃下长时间的存活率均优于未添加血红素的。发酵乳制品中的益生菌在食品冷藏、食用过程中会遇到各种各样的环境刺激，如氧气、低温和胃酸等，都会导致活力下降，只有具备较高环境胁迫耐受性的细胞才能更好地发挥功效。提高胞内ATP含量有利于增强细胞对不利环境的耐受性，而有氧呼吸产能效率高于发酵方式，进行有氧呼吸的细胞胞内ATP含量较高，因此比发酵方式培养的细胞更能适应不利的环境。可以预见，在包括益生菌制剂在内的乳酸乳球菌应用中，有氧呼吸具有潜在的应用前景。

现有技术中，由于乳酸乳球菌是兼性厌氧型微生物，培养乳酸乳球菌不需要通气，目前的理论认为乳酸乳球菌不能利用氧气，且会存在氧胁迫，即在有氧气存在条件下生长量反而较低。

现有的促进乳酸乳球菌有氧呼吸的方法是在培养基中添加血红素。但是，在乳制品生产中直接添加血红素，难免会有部分没有被细胞吸收利用的血红素残留在乳制品中，而大量游离血红素会通过其生物反应和促氧化效应对肾脏和其它脏器造成损伤，对人体健康不利。目前，发明人还尚未检索到其他与添加血红素效果相似、能够促进乳酸乳球菌进行有氧呼吸的相关文献资料。

发明内容

本发明提供一种促进乳酸乳球菌有氧呼吸的方法，该方法具有操作简单，成本低，实用性强等特点。

一种促进乳酸乳球菌有氧呼吸的方法，所述方法包括如下步骤：将活化好的乳酸乳球菌种子液接种到培养基中，在30±5℃的条件下培养所述乳酸乳球菌，培养过程中，向所述培养基中流加NaOH溶液，使培养基的pH值恒定为6.5±0.1，同时向所述培养基中通入无菌空气；

所述培养基或为M17培养基，或为CM培养基；

所述向培养基中通入无菌空气的通气量为2±0.3L·min^-1；

所述乳酸乳球菌种子液的制备方法为：活化好的乳酸乳球菌以5％的量接种于所述培养基中，在30±5℃、振荡频率150±50rpm的条件下培养至对数期；

所述NaOH溶液的浓度为10mol/L；

所述种子液以5％的量接种到培养基中。

控制乳酸乳球菌的发酵液pH值保持在6.5±0.1可以有效促进乳酸乳球菌进行有氧呼吸的机理如下：

现有文献报道，乳酸乳球菌缺乏完整的血红素合成途径，但具有外源吸收血红素的能力。发明人研究发现，乳酸乳球菌胞内具有编码血红素的生物合成途径，但是该途径的酶需要在较高的胞内pH值时可被激活。通过蛋白质组学和RT-PCR的研究证实，乳酸乳球菌中存在与有氧呼吸有关的琥珀酸脱氢酶酶蛋白和相应的编码基因，且该酶的表达和活性也与发酵液pH值呈正相关。乳酸乳球菌不能进行有氧呼吸的唯一障碍是自身缺乏血红素的合成能力。琥珀酰CoA是血红素的前体，而琥珀酰CoA是琥珀酸的直接前体，琥珀酸脱氢酶的作用底物是琥珀酸，因此，如果乳酸乳球菌胞内存在琥珀酸脱氢酶的活力，则表明乳酸乳球菌胞内必定有其催化底物-琥珀酸，以此推出，乳酸乳球菌胞内也必定存在琥珀酰CoA，从而也必定存在血红素。因此琥珀酸脱氢酶的活力与血红素之间是直接相关的。

发明人做了上述机理的证明实验，各实验组具体操作如下：

乳酸乳球菌乳脂亚种摇瓶实验组：在100mL锥形瓶中，活化后的乳酸乳球菌乳脂亚种种子液以5％接种量接入灭菌后冷却至常温的M17培养基，在30℃、振荡频率150rpm的条件下培养。

乳酸乳球菌乳脂亚种摇瓶+血红素实验组：在100mL锥形瓶中，活化后的乳酸乳球菌乳脂亚种种子液以5％接种量接入灭菌后冷却至常温的M17培养基，添加0.5mg/mL氯化高铁血红素母液使其终浓度为2μg/mL，在30℃、振荡频率150rpm的条件下培养。