[发明专利]一种家蚕核型多角体病毒免疫胶体金试纸条及检测方法

权利要求书

1.一种检测家蚕核型多角体病毒的免疫胶体金试纸条，其特征在于，所述免疫胶体金试纸条

包括：标记抗原BmNPV-Lef4抗体的胶体金垫和包被的硝酸纤维膜，其中硝酸纤维膜上部检测线包被兔抗BmNPV-Lef4，硝酸纤维膜下部的质控线包被羊抗鼠IgG。

2.根据权利要求1所述的一种检测家蚕核型多角体病毒的免疫胶体金试纸条，其特征在于，

其中所述兔抗BmNPV-Lef4的浓度为1～2mg/mL，羊抗鼠IgG浓度为0.5～1mg/mL。

3.一种家蚕核型多角体病毒的快速检测方法，其特征在于，所述的检测方法采用检测家蚕核

型多角体病毒的免疫胶体金试纸条，具体操作如下：

检测样品的采集：称取家蚕组织置于PBS缓冲液中，

进行研磨匀浆；然后，离心，用吸管吸取上清液；或直接吸取家蚕血淋巴置于离心管中待用；

取2～3滴步骤（1）中的上清液或血淋巴，滴到样品孔（S孔）中，等待2～5min

后即可观察结果；如分别在C（质控线）和T（检测线）处出现沉淀线，表明样品为BmNPV阳性；如果仅有C线出现，表明样品为BmNPV阴性；如果没有条带出现，表明该胶体金检测试纸条为不合格品。

4. 根据权利要求3所述的一种家蚕核型多角体病毒的快速检测方法，其特征在于，步骤（1）中家蚕组织与PBS缓冲液的比例为20～50mg：150～250μL。

5. 如权利要求1或3所述检测家蚕核型多角体病毒的免疫胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

（1）首先选择家蚕核型多角体病毒高度保守的早期核心基因Lef4进行克隆、表达和纯化，获得外源蛋白BmNPV-Lef4；

（2）制备BmNPV-Lef4抗原的多克隆抗体：

以纯化的蛋白BmNPV-Lef4为抗原，弗氏佐剂为乳化剂，按照常规方法免疫新西兰大白兔，制备BmNPV-Lef4的抗血清；再利用Protein A抗体纯化试剂盒进行纯化，获得BmNPV-Lef4的多克隆抗体，置于-80℃保存待用；

（3）制备小鼠腹水抗体，即鼠抗家蚕核型多角体病毒单克隆抗体：

以纯化的蛋白BmNPV-Lef4为抗原免疫BALB/c小鼠，制备筛选单克隆抗体； 

（4）制备BmNPV免疫胶体金检测试纸条：

A. 标记抗原BmNPV-Lef4抗体的胶体金垫制备：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，制备完成后将步骤（3）中制备的鼠抗家蚕核型多角体病毒单克隆抗体加入胶体金，边加边搅拌后，室温放置；在溶液中加入BSA，混匀，离心；去上清，将制备的胶体金标记抗体铺在玻璃纤维膜上，真空干燥，制成胶体金垫；

B．检测线和质控线抗体的包被：喷膜仪在硝酸纤维膜上部划线，以兔抗BmNPV-Lef4包被检测线；以羊抗鼠IgG包被硝酸纤维膜NC膜下部的质控线；

C．试纸组装：已包被IgG的硝酸纤维素膜、金标垫、玻璃纤维膜即样品垫和吸水纸按先后顺序粘于背板上。

6. 根据权利要求5所述的检测家蚕核型多角体病毒的免疫胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，其中步骤（4）的A中制备的胶体金粒径为20～50nm的胶体金；室温放置20min，加入的BSA的浓度为10%，BSA在溶液中的终浓度为1%。

7. 根据权利要求5所述的检测家蚕核型多角体病毒的免疫胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，其中步骤（4）的A中胶体金标记抗体按1mL铺20cm² 的比例铺在玻璃纤维膜上。

8. 根据权利要求5所述的检测家蚕核型多角体病毒的免疫胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，其中步骤（4）的A中每1mL胶体金溶液加入的鼠抗家蚕核型多角体病毒单克隆抗体为15-25μL。

9. 根据权利要求5所述的检测家蚕核型多角体病毒的免疫胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，其中步骤（4）的B中所述的兔抗BmNPV-Lef4浓度为1～2mg/mL，羊抗鼠IgG浓度为0.5～1mg/mL。