[发明专利]一种壳聚糖酶及应用该聚糖酶生产壳寡糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种壳聚糖酶及应用该聚糖酶生产壳寡糖的方法。

背景技术

壳聚醣是由D-氨基葡萄糖通过β-1,4键连接而成的多糖类，一般通过甲壳素(chitin)脱去乙酰基的方法来制成。这种壳聚糖作为分子量达到数十万道尔顿的高分子物质可应用于各种生产领域，但由于存在粘性高、不溶于中性或碱性水的问题而限制了其在生产上的应用。为了解决该技术难题，人们尝试了通过分解壳聚醣来制造水溶性壳寡糖的方法。通过尝试得知当所制成的壳寡糖具有6糖以上聚合度时，其具有较大的增强人体免疫性、抗肿瘤以及抗菌作用等，因此制造高聚合度壳寡糖成为现今该领域的研究趋势。

作为通过分解壳聚醣来生产水溶性壳寡糖的制造方法，已知的有酸分解法和酶分解法。虽然采用酸分解法的壳寡糖的制造方法比较简单，但经过壳聚糖分解而制造出来的壳寡糖中含有大量的单糖和二糖等超低分子，而这些超低分子的壳寡糖在增强人体免疫性、抗肿瘤和抗菌作用等方面较弱。相反，对于利用酶分解法而制造出来的壳寡糖的制造方法，虽然其具有根据所使用的酶可获得具有各种聚合度的壳寡糖的优点，但在酶分解法中作为核心部分的分解酶并没有得到充分开发，因此必须对高活性酶进行探索性研究。

作为分解壳聚糖的酶已知的有壳聚糖酶(Chitosanase)，其大多主要发现于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)细菌内。比如韩国10-0227040号专利涉及的芽孢杆菌属GM44、韩国10-0396833号专利涉及的芽孢杆菌属HSB-21、韩国10-0541044号专利涉及的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、日本公开专利公报昭61-280277号所涉及的芽孢杆菌属7-M、日本特开公报昭63-94971所涉及的环状芽胞杆菌(Bacilluscirculans)LCC-1、日本特开公报平2-79972号所涉及的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BN-262等。利用上述微生物制造壳聚糖酶时，其酶活性为1.0～5.4U/mL，比较低，因此限制了其在生产上的应用。另外，利用由上述方法制造出来的壳聚糖酶时，在壳聚糖的分解物中2糖或3糖含量为13～40％，比较高，相反，分解物中5糖和6糖以上的壳寡糖含量仅为20％以下。而且，目前在所开发的、用于壳寡糖生产的酶中，大部分壳聚糖酶的热稳定性较低，只能在50℃以下的较低温度下才能保持稳定，因此在与高聚合度壳聚糖酶的反应条件方面受到了限制。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术中的不足，提供一种热稳定性高、能够将壳聚糖分解成高度聚合糖的壳聚糖酶

为实现上述目的，本发明提供一种壳聚糖酶，该聚糖酶分离自土壤芽孢杆菌属AMI09菌株。

本发明的另一目的在于提供一种应用上述方案中聚糖酶生产壳寡糖的方法，所述聚糖酶为上述方案中所述的聚糖酶，包括如下步骤：

S1：从土壤试料中分离芽孢杆菌属AMI09菌株；

S2：培养芽孢杆菌属的AMI09菌株；

S3：从培养液中分离壳聚糖酶；

S4：制备壳寡糖的干燥粉末。

上述方案中优选的是，所述步骤S1中包括如下步骤：

a1:用灭菌蒸馏水稀释取自韩国庆南南海岸一带的土壤试料；

a2:将步骤a1中的土壤稀释液涂抹在MS琼脂培养基上进行培养；

a3:将步骤a2中培养基上的菌落进行纯化；

a4:测定各菌落的壳聚糖酶活性、分离得到符合条件的壳聚糖酶的AMI09菌株。

上述任一方案中优选的是，，所述a2步骤中MS琼脂培养基为含有0.5％壳聚糖、0.5％酵母提取物、0.2％K₂HPO₄、0.1％K₂HPO₄、0.07％MgSO₄7H₂O、0.05％NaCl、0.05％KCl、0.01％CaCl₂的培养基。

上述任一方案中优选的是，所述a2步骤中MS琼脂培养基为含有0.5％壳聚糖、0.5％酵母提取物、0.2％K₂HPO₄、0.1％K₂HPO₄、0.07％MgSO₄7H₂O、0.05％NaCl、0.05％KCl、0.01％CaCl₂的培养基。