[发明专利]一种重组副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原PotD及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原PotD及其制备方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis，HPS)引起家猪及藏猪的一种泛嗜性细菌性传染病，又称“革拉瑟氏病”(Glasser’s Disease)。随着规模化、集约化猪场的发展,副猪嗜血杆菌引起的以猪多发性浆膜炎、关节炎、呼吸困难、高热及高死亡率为特征的传染性疾病给养猪业带来巨大的经济损失,副猪嗜血杆菌引起的疾病已逐渐成为世界范围的重要疾病。

我国近年来才开始逐渐重视对副猪嗜血杆菌病的研究。副猪嗜血杆菌的血清型众多，目前已鉴别十五种血清型，还有15％-41％的未鉴定血清型，其中1，5，10，12，13和14为强毒株，而我国流行的血清型为4型和5。不同血清型的副猪嗜血杆菌毒力差异很大，我们对其毒力因子及致病机理知之甚少，至今尚无有效的通用商品苗和敏感的诊断方法，该病尚未得到有效控制，给全球养猪业带来巨大的经济损失。

我国至今没有像猪瘟兔化弱毒疫苗、伪狂犬基因缺失疫苗那样的成熟疫苗来针对副猪嗜血杆菌病，目前大多都是传统型灭活苗和弱毒苗，缺乏良好的保护力，导致临床病例多见。而灭活疫苗只能对同种血清型的菌株具有保护作用，缺乏交叉保护力。副猪嗜血杆菌血清型的多样性以及占很大比例的不能分型菌株影响了对具有高效交叉保护力疫苗的研制。亚单位疫苗同时具有活疫苗免疫效力高、交叉保护力强以及灭活苗的安全性好等优点，具有十分广阔的应用前景。大部分不能分型菌株副猪嗜血杆菌及其血清型的多样性影响了人们对于具有高效交叉保护力疫苗的研制。

PotD(Polyamine transport protein聚胺转运蛋白)参与大肠埃希氏菌生物膜的形成，属于ATP-结合匣(ATP-binding cassette)中的聚胺转运系统中的一员，该系统包含PotA，B，C和D，他们同属于亚精胺偏爱性的转运蛋白；而PotF，G，H和I则属于盐酸丁二胺偏爱性的转运蛋白。聚胺和盐酸丁二胺则是构成体内多价阴离子化合物的重要组成，普遍存在于包括原核生物在内的生物体内。细胞内聚胺过多或者过少都将造成细胞损害。同时发现，PotABCD中的任何一员缺失，都将导致整个转运系统无法转运聚胺，特别是亚精胺^[8]。因此作为聚胺转运系统中的重要一员，PotD对细菌的生长调节至关重要。

目前未见重组表达PotD基因的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种重组PotD蛋白及其制备方法。

本发明提供了一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明重组载体，其特征在于：包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。其中，所述的重组载体是重组pET28a质粒。

本发明重组菌，它包含前述的重组载体。其中，所述的重组菌为重组大肠杆菌。

本发明重组PotD蛋白，它由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码。它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明制备重组PotD蛋白的方法，包含如下步骤：

ⅰ、取权利要求5所述的重组大肠杆菌组菌，接种到添加有终浓度为50μg/ml的卡拉霉素的LB培养基上，37℃、280r/min摇床培养，至OD₆₀₀值达到0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.2～1.5mmol/L，25～42℃诱导表达1～7h；

ⅱ、离心，得菌体，裂解，取上清，分离纯化，即得。

步骤ⅰ中，IPTG的终浓度为1.0mmol/L，诱导表达的温度为30℃；诱导表达的时间为5h。

步骤ⅱ中，分离纯化的方法是：取沉淀，用的包涵体洗涤液重悬，离心，弃上清，重复前述步骤2次，即可；其中，包涵体洗涤液包含如下浓度的成分：50mmol/L Tris－HCl，0.5mol/L NaCl，2mol/L尿素，2％Triton。

本发明采用基因工程的方式成功的构建了基因工程菌，并表达得到了重组蛋白PotD。该重组蛋白PotD具有良好的免疫原性和保护原性，免疫后产生的PotD特异性抗体水平高，可以显著保护小鼠抵抗副猪嗜血杆菌血清5型强毒菌株的攻击，保护率高达80％，可以显著保护小鼠抵抗副猪嗜血杆菌血清5型强毒菌株的攻击，可以制备成为亚单位疫苗，预防副猪嗜血杆菌病，临床应用前景良好。