[发明专利]一种单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体及其制备方法和用途。

背景技术

肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，人类全身肿瘤中90％以上常见的恶性肿瘤都是实体瘤；随着环境污染的加剧，其发病率逐年上升。实体瘤的传统治疗方法以手术、化疗及放疗为主，但肿瘤的转移率和治疗后的复发率都较高，生存率仍不理想。因此，结合最新的肿瘤生理学和医学分子生物学研究成果，进一步研究开发新型高效的实体瘤治疗方法，具有重要的社会经济意义。

利用自杀基因治疗实体瘤是近年来肿瘤基因治疗的研究热点。所谓自杀基因治疗肿瘤就是用基因工程技术将特定的外源基因导入肿瘤宿主细胞或肿瘤组织中，该外源基因表达的蛋白质能够将无毒的前体药物分解成对肿瘤细胞有毒性的药物成分，直接杀死肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。然而，目前基因治疗面临的关键问题是如何解决载体的安全性和靶向性问题，选择一个高效、安全、特异性强的载体，是实现目的基因在肿瘤细胞中特异表达的前提。

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)/更昔洛韦(ganciclovir,GCV)是目前研究最早最彻底的，安全性较高，广泛用于肿瘤基因治疗的自杀基因系统之一。目前研究认为该自杀基因治疗肿瘤的机制有两个：一是自杀效应，即HSV-TK编码由376个氨基酸组成的胸甘激酶，导入肿瘤细胞后,这种胸苷激酶将无毒的更昔洛韦(GCV)磷酸化成单磷酸更昔洛韦,再进一步磷酸化为三磷酸更昔洛韦后,掺合到新合成的肿瘤细胞DNA链中,使DNA链断裂且抑制DNA聚合酶活性,从而干扰DNA合成导致肿瘤细胞死亡。另外一种是TK-GCV系统引发的“旁观者效应”，所谓“旁观者效应”即是转导的肿瘤细胞被敏感药物杀死的同时,周围未被转导的肿瘤细胞也被杀死的现象。HSV-TK/GCV系统通过这种独特的自杀效应或“旁观者效应”能选择性地杀死肿瘤细胞，保护正常组织细胞，从而避免传统的化疗等治疗方法对人体带来的伤害。自1986年Moolten首先报道腺病毒介导的HSV-TK基因可使肿瘤获得对某些药物的敏感性以来,国内外学者陆续将腺病毒介导的HSV-TK基因应用于肝癌、胃癌、舌癌、前列腺癌、黑色素瘤等实体瘤的基因治疗的实验研究,并取得了可喜进展。

然而，HSV-TK的天然底物是细胞中广泛存在的胸腺嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸。因此，利用天然的tk基因作为肿瘤靶向基因治疗的候选基因，在实际应用中必然存在细胞内丰富的天然的胸腺嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸与GCV相互竞争TK活性部位的弊端。从而在实际应用中会减小GCV与TK的作用几率而减弱其治疗效果，或者为了达到预期的治疗效果而不得不增加GCV的剂量，增加治疗成本和药物的副作用。

因此，采用天然的单纯疱疹病毒胸苷激酶治疗肿瘤，存在疗效不佳、副作用大的弊端。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种单纯疱疹病毒胸苷激酶的突变体及其制备方法和用途。

本发明提供了一种如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

还提供了一种重组载体，它包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。优选地，所述的重组载体是重组pET32质粒或者重组pBES载体。

pBES载体，记载于专利号为ZL200710092976.6的专利文件中。

还提供了一种重组菌，它包含前述的重组载体。优选地，所述的重组菌为重组大肠杆菌或者重组双歧杆菌。

本发明单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体，它由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列编码。它的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了一种制备前述单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体的方法，包含如下步骤：

ⅰ、取权利要求5所述的重组大肠杆菌组菌，接种到添加有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基上，37℃、250r/min摇床培养12h；

ⅱ、取步骤ⅰ的菌液按1：100的接种量转接至LA培养基中，37℃、200r/min摇床中培养，至OD₆₀₀值达到0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，37℃诱导表达5h；

ⅲ、离心，得菌体，裂解，取上清，分离纯化，即得。

步骤ⅲ中，所述分离纯化采用His-tag磁珠纯化试剂盒分离纯化。

本发明还提供了前述核苷酸序列重组载体、重组菌、单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。