[发明专利]分泌抗柑橘衰退病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗柑橘衰退病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus , CTV) 广泛分布于世界各柑橘产区, 其引起的衰退病是最具危害性的柑橘病害之一, 该病毒主要通过蚜虫和带毒接穗传播。CTV 存在明显的株系分化现象, 除少数株系在某些柑橘品种上不产生可见症状外, 大部分株系能在柑橘上产生明显症状, 常见症状可分为三大类型, 即速衰型、茎陷点型和苗黄型。速衰型症状主要表现在以酸橙作砧木的甜橙等感病柑橘上; 茎陷点症状的发生与砧木种类无关, 常导致葡萄柚或甜橙产量降低、品质下降、植株矮化; 苗黄症状在田间很少发生, 主要是在酸橙、来檬或葡萄柚的苗期引起严重褪绿和矮化。CTV 为长线形病毒科(Closteroviridae) 长线形病毒属( Closterovirus )成员, 病毒粒子细长弯曲, 大小约2 000nm × (10～12) nm , 其基因组全长约为2 ×104 个核苷酸, 是已知植物病毒中基因组最大的病毒。CTV具有2 种外壳蛋白, 其中主要外壳蛋白(CP) 分子量为25 kD , 包裹了病毒粒子长度的95 %; 次要外壳蛋白(dCP) 分子量为27kD , 包装在病毒粒子的尾部。针对CTV 引起的柑橘衰退病, 各国普遍采取的防治措施是使用无病毒的种苗和采用抗病或耐病砧木。而在美国和巴西等国利用弱毒株系对强毒株系的交叉保护作用对该病取得了很好的控制效果。病毒的检测是无病毒种质培育和弱毒株系筛选过程中的一个重要环节, 目前, 美国、西班牙、日本和意大利等国均已研制出针对该国特定CTV 株系的血清学检测试剂盒。我国对CTV 的研究始于20 世纪50～60 年代, 大量的研究表明该病毒的多种株系在我国有广泛的分布, 传毒性强的介体褐色橘蚜( Toxoptera citricida Kirkaldy) 也广泛存在, 随着我国柑橘品种结构的调整, 强毒株系的危害变得日益严重。近些年来, 柑橘无病毒种质的培育和具有区域化特点的弱毒株系筛选已引起我国相关科研工作者的高度重视。而目前仅用低效率的电镜观察、RT-PCR方法和核酸杂交、RT-PCR等方法对小样本进行病毒检测。本发明以原核表达的CTV衣壳蛋白（CP）为抗原通过杂交瘤技术制备了1株抗CTV的特异性单克隆抗体，以制备的单抗为核心建立了检测CTV的高通量的血清学方法，并成功应用于田间CTV的检测，从而为我国柑橘衰退病毒病早期监测和预警、检测、科学防控提供物质和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗柑橘衰退病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用。

分泌抗柑橘衰退病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株14H11，能分泌抗柑橘衰退病毒的特异性单克隆抗体，杂交瘤细胞株14H11于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9335；

杂交瘤细胞株分泌的抗柑橘衰退病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-8，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与柑橘衰退病毒的外壳蛋白亚基有特异性免疫结合反应，该单抗检测病叶的灵敏度达到1:10240倍稀释；

杂交瘤细胞株14H11分泌的抗柑橘衰退病毒的单克隆抗体仅与柑橘衰退病毒有特异性免疫反应，而与柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病类病毒、柑橘花叶病毒、柑橘皱叶病毒、柑橘粗糙病毒、柑橘鳞皮病毒、香蕉线条病毒、黄瓜花叶病毒、番茄花叶病毒、齿兰环斑病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、小西葫芦黄化花叶病毒、烟草花叶病毒、瓜类褪绿黄化病毒、菜豆普通花叶病毒、芜菁花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒、马铃薯S病毒、油菜花叶病毒、番茄斑萎病毒、建兰花叶病毒、水稻黑条矮缩病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、小麦线条花叶病毒、甘蔗花叶病毒均不发生免疫反应。

抗柑橘衰退病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1）提供的杂交瘤细胞株能分泌抗柑橘衰退病毒的特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA和TAS-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏的检测柑橘衰退病毒；2）利用本发明所制备的单克隆抗体检测柑橘衰退病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3）利用本发明所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间植物中柑橘衰退病毒的检测。