[发明专利]一种牛支原体检测试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

 本发明涉及一种生物检测试剂制备方法及试剂，确切讲本发明涉及一种牛支原体抗体检测试纸条制备方法及其所制备的检测试纸条。

背景技术

牛支原体是一种严重的致病性病原体，能够引起牛呼吸道疾病、奶牛乳腺炎、关节炎、角膜结膜炎、生殖道炎症以及流产与不孕等多种疾病，并且一旦感染能够引起其它病原的继发感染，例如化脓性隐秘杆菌，多杀性巴氏杆菌，溶血性曼氏杆菌、昏睡嗜血杆菌、牛副流感病毒3型、疱疹病毒1型、牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛冠状病毒等。牛支原体发病率为50%-100%，病死率高达10%-50% ，给我国养牛业造成了巨大的经济损失。本病在我国的实际流行情况和准确的流行病学信息仍较为匮乏，造成这种现象的原因，主要是我国目前缺乏有效的牛支原体检测的相关技术。

    目前存在的检测牛支原体的技术有：1.病原分离鉴定，但是牛支原体分离往往受到临床应用抗生素的影响，分离困难，且分离用培养基营养要求高、分离物鉴定难度大、灵敏度低, 不能做为早期快速诊断牛支原体感染的方法, 也难以作为常规检测方法普及推广（出自Caswell J L, Archambault M. Mycoplasma bovis pneumonia in cattle）；2.PCR检测方法（出自Thomas A, Dizier I, Linden A, et al .Conservation of the uvrC gene sequence in Mycoplasma bovis and its use in routine PCR diagnosis），该检测方法需要对病料样品进行较复杂的处理（研磨、离心、提取DNA等），检测方法虽灵敏，但容易因污染和处理不当比较容易出现假阳性，影响判定结果的准确性，此外也需要一定的实验室条件和仪器设备，以及较高成本，不适合临床或基层使用。3.间接ELISA 是目前应用最主要的血清学检测方法，国际上先后有用全菌蛋白包被和表达蛋白作为包被抗原的方法（出自Grand D L, Calavas D, Brank M, et al. Serological prevalence of Mycoplasma bovis infection in suckling beef cattle in France），全菌蛋白的方法特异性不足现已很少应用，表达蛋白抗原ELISA方法目前已有商业化产品，但其所用哪一个抗原蛋白并未公布。此外，ELISA方法仅适合在实验室进行检测，操作步骤相对复杂，需要专业人员进行操作，且需要一定的实验室条件和仪器设备进行检测和分析结果。4.利用P48重组表达蛋白包被绵羊红细胞建立的间接血凝检测方法，操作相对简单，但也需要2~3小时才可判定结果，灵敏性弱，需要特定的恒温培养箱。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足，能简捷、快速、灵敏的检测牛支原体血清抗体、乳清抗体的检测试纸条制备方法，以这用这种方法制备的试纸条。

本发明的一种检测牛支原体抗体的试纸条由底板、设置于底板上依次线性排列的样品吸收垫、包被有抗原的胶体金垫、硝酸纤维膜和吸水垫组成，在硝酸纤维素膜上包被有质控线与检测线，本发明试纸条中的胶体金垫包被的抗原为牛支原体P48融合蛋白，检测线包被的是山羊抗牛二抗IgG，质控线为兔源P48融合蛋白的多抗IgG。

本发明的检测牛支原体抗体的试纸条的制备方法是：用经纯化后透析的P48重组蛋白包被胶体金制备胶体金垫；在硝酸纤维素膜上包被质控线与检测线，其中：检测线的所用抗原为亲和纯化山羊抗牛二抗IgG，质控线抗原为P48蛋白多抗IgG，在底板上依次分别将样品吸收垫、胶体金垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫按顺序装配。

本发明的检测牛支原体抗体的试纸条的制备方法中：胶体金包被P48蛋白的浓度为6ug/ml,抗原包被1%金溶胶的时间为30min，在抗原结合的过程加入20%BSA溶液（20gBSA加入到100ml去离子水中）50ul/ml进行封闭，封闭时间为30分钟，离心后利用重悬液将胶体金颗粒重悬制备胶体金垫，然后干燥处理，重悬液配方为：0.02M四硼酸钠、0.5% BSA、3%蔗糖、0.5%酪蛋白，0.5%吐温20，用重悬液有助于金标垫更好的解离，重悬液中的BSA能够封闭非特异性位点避免假阳性的出现，酪蛋白与蔗糖成分能够保护金颗粒包被的抗原。包被硝酸纤维素膜检测线的所用亲和纯化山羊抗牛二抗IgG抗原浓度为100ug/ml，包被量为1ul/cm，包被硝酸纤维素膜质控线P48蛋白多抗IgG抗原浓度为200ug/ml，包被量为1ul/cm。