[发明专利]L‑天冬氨酸氧化酶变体和使用所述变体生产喹啉酸或烟酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及L-天冬氨酸氧化酶变体，包括编码所述L-天冬氨酸氧化酶变体的基因的生产喹啉酸的微生物，和使用所述微生物高效生产喹啉酸或烟酸的方法。

背景技术

烟酸是尼古丁的氧化物和复合维生素B的一员。它是一种水溶性维生素，也被称为尼克酸，或维生素B3，并在动物和植物中普遍存在。烟酸的缺乏可能会导致糙皮病或神经病变。通常，烟酸在体内以烟酸酰胺辅酶的形式存在，即，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，并参与氧化还原反应。

喹啉酸(quinolinate)，其也被称为喹啉酸(quinolinic acid)，其由喹啉的氧化产生。喹啉酸已知具有神经毒性并导致多种神经障碍。喹啉酸也被认为是烟酸的前体。

广泛地适用于食品和药品的烟酸可以通过化学合成法或生物学生产方法制备。化学合成烟酸可能导致包括催化剂在内的大量有毒废料。因此，该废料需要彻底的管理和高额费用进行处理。此外，作为前体的嘧啶具有多种衍生物，且嘧啶的供应和价格波动导致烟酸不稳定的价格。

为了从化学合成方法解决这些问题，研究了通过使用来源于可再生的碳水化合物的材料生产烟酸的生物方法。主要通过两种生物合成途径完成烟酸的生物学生产，其中之一是由色氨酸作为真核生物起始原料开始的烟酸生物合成途径，另一种是由天冬氨酸作为原核生物起始原料开始的。两种途径都使用喹啉酸作为中间体，且通过喹啉酸磷酸核糖基转移酶(nadC)、烟酸-单核苷酸腺苷转移酶(nadD)、NAD合成酶(nadE)、烟酰胺-核苷酸腺苷转移酶(NMN nadR)和烟酰胺酶(pncA)的作用，从喹啉酸生物合成烟酸。

经由天冬氨酸的途径使用重组大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌的烟酸的生物合成的方法已经公开(韩国专利号10-1223904)。本发明的发明人研究了从烟酸的这些生物合成方法解决问题并改善喹啉酸或烟酸的产率，发现了涉及喹啉酸的高产率生产的酶变体，并完成了本发明。

发明详述

技术问题

本发明提供了L-天冬氨酸氧化酶的变体，其显示出由烟酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)导致的反馈调节被解除。

本发明提供了生产喹啉酸的微生物，所述微生物包含L-天冬氨酸氧化酶的变体。

本发明提供了通过培养微生物生产喹啉酸的方法。

本发明提供了通过培养微生物和喹啉酸的脱羧生产烟酸的方法。

技术方案

本发明的一个方面提供了L-天冬氨酸氧化酶的变体，其具有在SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列中的第302位氨基酸被其他氨基酸取代的氨基酸序列。

L-天冬氨酸氧化酶具有将L-天冬氨酸氧化成亚氨基琥珀酸的催化活性，如反应式1所示。

<反应式1>

L-天冬氨酸+富马酸<＝>α-亚氨基琥珀酸+琥珀酸+H⁺

L-天冬氨酸+氧<＝>过氧化氢+α-亚氨基琥珀酸+H⁺

本发明的L-天冬氨酸氧化酶可包括表示为SEQ ID NO：1的氨基酸序列。然而，它并不限于此，因为取决于微生物物种或菌株，蛋白质的氨基酸序列可能存在差异。换言之，它可以是突变体蛋白或人工变体，该突变体蛋白或人工变体具有在由SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列的一个或多个位置包含一个或多个氨基酸的取代、删除、插入或添加的氨基酸序列，只要它可以将L-天冬氨酸氧化成亚氨基琥珀酸。本文中，"多个″可依据蛋白质的氨基酸残基的三维结构中的位置或类型而有所不同，但具体地是指2至20，特别是2至10，且更具体地2至5。此外，若基于在个体或微生物的种类的差异，氨基酸的取代、删除、插入、添加或反转包括由人工变体或天然突变引发的那些。

编码本发明的氨基酸序列的多核苷酸可包含编码具有表示为SEQ ID NO：1的氨基酸序列、或与其同源性为80％或更多的氨基酸序列、特别是90％或更多的氨基酸序列、更具体地95％或更多的氨基酸序列、特别具体地97％或更多的氨基酸序列的蛋白的多核苷酸序列，只要它具有与L-天冬氨酸氧化酶类似的活性。最具体地，它可以是由SEQ ID NO：24所表示的多核苷酸序列。

术语“同源性”是指两个氨基酸序列之间的同一性，且其可由本领域技术人员熟知的方法确定，用BLAST2.0来计算参数，例如得分、同一性和相似性。