[发明专利]利用幼嫩子房对烟草单个植株进行染色体制片的方法

说明书

技术领域

本发明属于农业技术领域，本发明涉及一种利用幼嫩子房进行烟草染色体制片的方法，特别适用于对单个烟草植株进行染色体制片。

背景技术

植物染色体制片是进行核型分析、带型分析和染色体原位杂交等细胞遗传学研究的基础，随着近年来细胞遗传学在植物分类学及植物育种中的应用，植物染色体制片的应用越来越广泛。特别是在育种中，很多情况下，需对单个(株)材料进行染色体制片，且制片质量要求甚高，这在很大程度上提高了对染色体制片的要求，无疑也增加了染色体制片的难度。尤其是一些种子细小的植物材料，其制片难度更大。

目前，植物染色体制片大多采用根尖，少数采用幼嫩叶片及花器官的不同部分。烟草染色体研究中大多采用根尖进行染色体制片，但其可能需大量根尖作为处理对象，方可获得比较优良的染色体标本。但是烟草育种过程中，往往会获得的部分具有染色体结构和数目发生变异的特殊材料。在研究过程中，要求对这部分材料的每个单株进行染色体制片。由于烟草种子细微，萌发后的根也较小，这给对单个植株进行染色体制片造成极大的难度，且根尖的切取往往对植株造成不利的影响，如影响生长势、感染病菌等。

因此，开发一种取材方便，可获得较多分裂相的制片方法对在烟草育种中筛选染色体变异株系并对其进行细胞遗传学研究有着非常广阔的应用前景。有学者报道采用叶片、组织培养材料进行烟草染色体制片的方法。但是由于叶片多居间分生组织，无法获得大量分裂相，不能满足后续分析需要；而组织培养的材料含水量较高，且老化组织和幼嫩组织混合，也难以获得良好的染色体制片。由于烟草花序发育较快，在单核小孢子期前子房生长迅速。因此，选用这一时期的子房作为材料进行染色体制片时合适的。且烟草花期较长，有大量材料可供选择进行染色体制片。目前，还未见有关利用烟草幼嫩子房进行染色体制片的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种取材方便，可获得较多分裂相、分裂相染色体较为舒展的制片方法。为实现上述发明目的，本发明拟采用如下技术方案：

本发明涉及一种利用幼嫩子房进行烟草染色体制片的方法，其特征包括如下步骤：

(1)取材：于花期对单个烟草植株进行取材，取材时间为晴朗早上8:00-9:00之间，取材对象为幼小花蕾，以小孢子母细胞减数分裂期花蕾为佳，因不同材料花蕾大小存在差异；

(2)预处理及固定：用眼科镊将花蕾取下，去掉花柄后放入装有蒸馏水的小玻璃管中，轻轻振荡使花蕾浸入溶液中。后置于4℃冰箱放置18-24h(温度及时间可根据染色体形态自行调整)，吸出蒸馏水，加入卡洛氏固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)，固定过夜；

(3)后续采用直接涂片、酶解后压片或涂片方法得烟草染色体制片。

任选地，压片后直接观察，获得良好中期分裂相，如需后续试验和长期保存，可采用常规方法揭片；直接涂片和酶解后涂片还包括染色步骤:用5％吉姆萨溶液进行染色,染色体时间控制在30秒至1分钟之间。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的直接涂片包括如下步骤：从玻璃瓶中取出固定好的花蕾，用眼科镊剥去花萼、花冠、雄蕊和柱头；用镊子夹取子房使其碎裂为小块，用镊尖夹取小块组织并滴加少量卡洛氏固定液于镊尖，直接在清洁、干燥的载玻片上涂抹，待材料涂布均匀后，滴加一滴固定液于涂布好材料的载玻片上，将固定液沿载玻片一端轻轻吹散开；于酒精灯火焰上微烤至固定液呈液滴状即可。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的酶解压片、涂片包括如下步骤：

(4)酶解：从玻璃瓶中取出固定好的花蕾，用眼科镊剥去花萼、花冠、雄蕊和柱头，切除花托，并将子房分解为合适大小(边长约1-1.5毫米的方形块)后置于离心管中，加入蒸馏水清洗2次，后加入蒸馏水浸泡约20分钟，吸出蒸馏水，加入混合酶液(3％纤维素酶+0.03％果胶酶，不同厂家、批次的酶液可适当调节浓度)，酶和子房体积比为8-12:1，浸没材料，震荡使组织块在酶液中悬浮，于35℃恒温箱中放置,1.0-1.5小时(可根据材料调整)后取出；

(5)低渗处理：酶解后的材料从恒温箱中取出后，尖嘴吸管吸出酶液，加入蒸馏水，放置10-15分钟后吸出蒸馏水，加入卡洛氏固定液；

(6)压片：用镊子小心夹取材料，至于清洁干燥的载玻片中央，滴加一滴卡包品红染色液，用镊子反复夹取材料使其分散于染液中，染色约1分钟后，夹取清洁盖玻片常规方法压片即可。

可选择地：