[发明专利]非洲猪瘟病毒VP73蛋白特异性多克隆抗体的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术和免疫学技术领域，具体涉及抗非洲猪瘟病毒抗原性结构蛋白VP73蛋白特异性腹水多克隆抗体，以及制备方法和用途。

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)主要是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病,是世界动物卫生组织(OIE)规定的法定报告动物疫病。临床上以高热、皮肤充血、内脏器官出血、高死亡率为特征。非洲猪瘟自1921由肯尼亚首次报道以来，已蔓延至非洲、欧洲、美洲加勒比海地区和欧亚接壤地区的49个国家。无论在非洲猪瘟新发地区还是流行地区，疫情的爆发和流行都会对发病国家产生严重的社会经济影响。非洲猪瘟虽然不感染人，但对于那些把猪肉及其相关猪制品作为主要动物蛋白来源的国家，非洲猪瘟的流行大大降低了猪产品的供应能力，改变当地居民的饮食结构，间接对人体健康造成危害。

ASFV属于双链DNA病毒目(dsDNA)、非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)、非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)，而且是其唯一已知的代表物种。ASFV有囊膜呈二十面体对称，平均直径200nm，结构复杂。基因组约为170-192kb，与痘病毒相似，具有发夹结构、末端反向重复序列以及早期RNA合成所必需的酶。整个基因组有151个ORF，其编码的蛋白中有131种病毒蛋白的结构和功能已有报道。

ASFV可以编码34种以上的结构蛋白，VP73蛋白作为ASFV主要的抗原性结构蛋白，包含396个氨基酸，分子量约为44.8KDa，抗原性稳定，能够诱导机体产生中和抗体，选择ASFV VP73蛋白作为免疫原制备特异性的单克隆抗体、多克隆抗体，从而建立ELISA、免疫印迹技术、间接免疫荧光等方法来检测ASF具有明显的优势性。

2007年至2014年7月，越来越多的国家遭受到非洲猪瘟的侵袭，先后在格鲁吉亚、亚美尼亚、阿塞拜疆、俄罗斯、乌克兰、白俄罗斯等国暴发，造成巨大的经济损失，也严重威胁我国的养猪业。俄罗斯：6月20日-7月8日在卡卢加州、斯摩棱斯克州、普斯科夫州、诺夫哥罗德州发生12起非洲猪瘟疫情，发病野猪5头，病死野猪4头，野猪病死率80％，扑杀野猪1头；发病猪34头，病死猪23头，病死率67.65％。拉托维亚：7月2日-13日发生11起非洲猪瘟疫情，发病野猪10头，病死野猪9头，销毁野猪1头；发病猪4头，扑杀猪47头。波兰：6月-7月在波德拉谢省发生4非洲起猪瘟疫情，发病野猪12头，病死野猪12头。立陶宛：2014年7月底，在立陶宛伊格纳利纳区一家大型农场发现大规模非洲猪瘟疫情，该农场约2万头猪都被宰杀，以防止疫情扩散。8月，立陶宛又在乌泰纳区一家私人农场发现非洲猪瘟疫情。

随着非洲猪瘟流行的区域在逐渐扩大并有蔓延至我国的风险，已经引起我国的兽医工作者们的高度重视并开展相关储备性研究，针对ASFV相关基因的多克隆抗体的制备已有相关报道，多是采用将抗原免疫兔或大鼠收获抗血清，如李洪利等(2012)利用原核表达的VP73蛋白免疫新西兰大白兔获得抗VP73蛋白多克隆抗体的高免血清；如何提供一种快速、经济、特异性良好的多克隆抗体制备方法无疑会加速我国对非洲猪瘟免疫学研究以及及早的建立非洲猪瘟血清学检测方法奠定基础。

目前，实验室制备多克隆抗体一般采用将提纯的病毒核芯颗粒或表达抗原免疫大白兔或大鼠后获得相应的兔源、鼠源的抗血清多克隆抗体，但未见利用腹水制备多克隆抗体的制备方法。本发明首次提出了抗ASFV VP73蛋白腹水多克隆抗体的制备，制备的腹水多克隆抗体特异性效果等同于常规抗血清制备方法获得的多克隆抗体，但与常规方法相比，腹水多克隆抗体的制备有着抗原用量少、经济、易操作、腹水可反复抽取等优点，制备的腹水多克隆抗体已通过本实验在Western blot、ELISA等检测技术上成功应用。制备的ASFV VP73蛋白腹水多抗能与VP73原核表达蛋白发生特异性结合，而对照无蛋白带出现，说明所获得的多抗对VP73原核表达蛋白具有良好的特异性。因此，腹水多克隆抗体的制备方法可以代替常规抗血清制备多克隆抗体方法，不仅对研究ASFV VP73蛋白的功能有重大意义，而且对建立特异、敏感、快速的ASFV免疫学检测方法(如ELISA)也有重要的意义。

【发明内容】

本发明的目的在于，提供一种经济、易操作、抗体特性好的抗ASFV VP73蛋白腹水多克隆抗体的制备方法。腹水多克隆抗体的制备方法可以代替常规抗血清制备多克隆抗体方法。

本发明的内容涉及一种非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特异性多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：