[发明专利]合成高纯2‑酮酸盐的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型生物法合成2-酮酸及分离纯化得到医药级酮酸盐的方法，属于生物合成领域。

背景技术

2-酮酸盐主要用于生化试剂、体外诊断、化妆品添加成分，另外还是重要的医药中间体,主要用于健身减肥膳食补充剂。由2-丁酮酸等配置的试剂盒被广泛应用于ɑ-羟丁酸脱氢酶的检测，并作为心肌梗死、贫血、白血病、肝硬化等病症的诊断依据。丙酮酸钠是测定乳酸脱氢酶的底物，主要用于肝功能试验中谷-丙转氨酶活力测定。2-戊酮酸钠主要用于低血钙、荨麻疹、血管神经性水肿等过敏疾患。

这些化合物现在主要是化学法合成，专利CN103073411A公布的是：草酸酯类在超低温无水条件下，以四氢呋喃为溶剂加入乙基溴化镁反应。产物再通过减压精馏纯化，乙酸乙酯萃取，大量的碱金属氢氧化物的甲醇溶液中降温结晶得到丁酮酸盐。在其中使用大量的有机溶剂，其回收率低，后处理步骤工序多，难度大。再者化学法收率低，成本高，不适宜于工业化生产。目前，生物法方面虽然有相关文献报道生物发酵提取丙酮酸，但是主要目的集中在基因表达和酶的发酵、提取方面。专利CN101205181A公布的是双膜二步发酵提取分离丙酮酸钠，其发酵液经超滤膜过滤除去残余菌体、蛋白质、糖类、色素，再经薄膜浓缩后加入大量90％的乙醇沉淀得到的结晶粉经甲醇清洗后干燥筛分得成品。整个过程对设备要求严苛，提取的收率比较低，特别是后期的纯化过程使用大量的有机溶剂，其回收率低，企业后处理步骤工序多，难度大。

发明内容

针对现有化学方法合成酮酸盐的方法存在收率低，提纯难，并且有机溶剂使用量大、回收困难，造成成本高，环境污染，同时化学方法处理步骤繁琐，不利于工业生产等一系列的缺陷；本发明的目的是在于提供一种操作简单、反应条件温和，成本低，高产率制备高纯度2-酮酸盐的方法。

本发明提供了一种合成高纯2-酮酸盐的方法，该方法是在反应液中，具有式1结构的醛类化合物和甘氨酸原料在L-苏氨酸醛缩酶和L-苏氨酸脱氨酶复合酶的催化作用下，于pH为6.0～8.0，温度为20～40℃的条件下进行酶催化反应，生成具有式2结构的2-酮酸产物；所得2-酮酸产物经层析分离提纯后，采用碱金属碳酸盐或碱金属碳酸氢盐调节pH至4.0～8.0，再依次进行活性炭脱色、浓缩结晶、真空干燥，即得具有式3结构的2-酮酸盐；所述的L-苏氨酸醛缩酶和L-苏氨酸脱氨酶复合酶中L-苏氨酸醛缩酶与L-苏氨酸脱氨酶的总活力比为3～4:2～3；

其中，

R为C₁～C₄的脂肪烃基；

M为碱金属离子。

本发明的合成高纯2-酮酸盐的方法还包括以下优选方案：

优选的方案中R为C₁～C₄的直链烷烃基或直链取代烷烃基、烯烃基或取代烯烃基、炔基或取代炔基中一种。

优选的方案中L-苏氨酸醛缩酶相对醛类化合物的加入量为30000U/mol～ 80000U/mol；最优选为30000U/mol～50000U/mol。

优选的方案中L-苏氨酸脱氨酶相对醛类化合物的加入量为20000U/mol～60000U/mol；最优选为20000U/mol～40000U/mol。

优选的方案中醛类化合物在反应液中的质量百分比浓度为2％～6％，醛类化合物与甘氨酸的摩尔比为1:1～1.05。

优选的方案中碱金属碳酸盐为Na₂CO₃或K₂CO₃。

优选的方案中碱金属碳酸氢盐为NaHCO₃或KHCO₃。

优选的方案中活性炭脱色是将提纯和调节pH后的2-酮酸产物维持温度在20～40℃范围内，加入活性炭进行吸附0.5～1.0h。

优选的方案中活性炭为木质活性炭。

优选的方案中活性炭的使用量为提纯和调节pH后的2-酮酸产物体积的3.0～5.0‰。

优选的方案中酶催化反应以反应液中甘氨酸残留量低于0.2wt％为反应终点。

优选的方案中真空干燥是在真空度大于0.09MPa，温度在60～80℃范围内的条件下进行。

优选的方案中层析分离是通过离子交换树脂或吸附树脂进行分离；所述的离子交换树脂为强酸性的磺酸型树脂，所述的吸附树脂为疏水性的吸附树脂。