[发明专利]将引物或引物、探针固定于固相载具用于PCR的方法

说明书

技术领域

本发明涉及PCR反应（Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应，一种用于体外扩增核酸片段的技术）实验技术领域，尤其是一种将引物或引物、探针固定于固相载具用于PCR的方法。

背景技术

PCR板是普通PCR试验或荧光定量PCR试验中常用的分子生物学耗材，分为48孔PCR板、96孔PCR板、384孔PCR板、8联管和单孔PCR反应管。PCR板的使用方法是通过加入PCR反应引物、探针、酶混液（DNA聚合酶与缓冲液的混合液或DNA聚合酶、逆转录酶与缓冲液的混合液）、水和模板核酸（DNA、RNA）,混合后放入PCR仪或实时荧光定量PCR仪上进行PCR反应。这种方法的不足之处在于：1、检测或扩增同一个基因、进行多个PCR反应时，需要向多个PCR反应管（孔）内重复加入相同的引物和探针；2、检测或扩增不同的基因、进行多个PCR反应时，需要向不同的PCR反应管（孔）内加入不同的引物和探针。这样，既耗费实验人员时间，工作量大，工作效率低，又容易出错，引物或探针加错孔位，从而直接影响实验结果的及时性、准确性和重复性。例如：1、检测60份标本中的乙肝病毒基因，就需要重复60次向60个PCR反应管（孔）内加入乙肝病毒基因的引物和探针，工作量大，耗时长，工作效率低，实验人员也很辛苦；2、同时检测30份标本中的乙肝病毒基因和丙肝病毒基因，就需要重复30次向30个PCR反应管（孔）内加入乙肝病毒基因的引物和探针，再重复30次向30个PCR反应管（孔）内加入丙肝病毒基因的引物和探针，不仅工作量大，耗时长，还有可能加错管（孔）位，得出错误的结果。

发明内容

为了克服现有的技术的不足，本发明提供了一种将引物或引物、探针固定于固相载具用于PCR的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种将引物或引物、探针固定于固相载具用于PCR的方法，其方法如下：

步骤一、引物或引物、探针按相关主题溶解：引物、探针合成后，按引物、探针终浓度100uM 的需要量，加入缓冲液，短暂离心使加入的缓冲液全部沉积到PCR管或孔底部，保证引物、探针充分溶解到缓冲液中，室温放置1h，形成母液；

步骤二、在无菌实验室里，将上下游引物、探针分别从步骤一的100uM母液中取出10ul分装，再加入10-90ul 缓冲液稀释到10-50uM，形成使用液，4℃保存备用。根据进行的单重或者多重PCR反应需要，将该使用液加入固相载具的PCR反应管或孔中；

步骤三、将已加入引物或引物、探针的固相载具放入烘箱中，直至将加入的液体水分蒸干，加入的引物或引物、探针即被贴壁固定，此时即形成固化的引物层或引物、探针层；

步骤四、将带有固化的引物层或引物、探针层的固相载具用封板膜封板，4℃保存，以待备用。

本方案可将引物层或引物、探针层很好地固定于固相载具上，解决现有技术的工作量大、工作效率低、实验时间长、容易出现加孔错位等问题。其中，固定的引物或引物、探针可以是1对引物，多对引物，1对引物探针，或多对引物探针等，此处不应当受到限制。

根据本发明的另一个实施例，进一步包括，所述步骤三中将已加入引物或引物、探针的固相载具放入烘箱中，该烘箱为普通烘箱或其它形式的加热烘干器具。本方案中使用的烘箱应当不受限制，其目的是为将引物或引物、探针烘干固化。

根据本发明的另一个实施例，进一步包括，所述步骤三中将已加入引物或引物、探针的固相载具放入烘箱中，烘干温度在35℃至95℃温度范围内，烘干时间为5分钟至3小时（固相载具可用的温度所对应的烘干时间如下表）。其中，优选的烘干温度为50℃，烘干时间为2小时。