[发明专利]悬浮培养细胞生产金线莲多糖的方法

权利要求书

1. 悬浮培养细胞生产金线莲多糖的方法，其特征在于，是一种利用细胞培养反应器对金线莲细胞培养，添加植物生长调节剂和生物酶制剂激活细胞生长并缩短细胞培养周期，来生产金线莲多糖的方法，具体步骤为：

培养阶段

（1）单细胞制备

取金线莲蒴果，按照组培技术要求消毒后进行无菌播种，播种培养基为改良的1/2MS固体培养基，待萌发成原球茎后取出，选择色泽鲜艳、个体硕大、活力旺盛的原球茎，采用酶解法分离制备单细胞，用60微米孔径的微孔滤器过滤，滤液经低速离心机分离，收集沉淀下的细胞；

（2）单细胞系培养

将收集到的单细胞接种到含有改良的1/2MS液体培养基的挡板摇瓶中，鲜细胞接种量为25±2g/L，光强度为2000lux，色温为6000K，震荡培养，调pH值为5.6±2，温度22±2℃，当细胞密度达到20000个/mL，即可放大培养；

（3）细胞群放大培养

将培养好的单细胞系接种于含有改良的1/2MS液体培养基的气升式搅拌发酵罐中，培养基中加入：NAA 1.0mg/L，6-BA 1.0mg/L，中性果胶酶80mg/L，中性纤维素酶20mg/L，鲜细胞接种量为30±2g/L，光强度为4000lux，色温为6000K，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶氧在30%，调节补料液和NaOH溶液流加量保持pH在5.6±4；

（4）当细胞密度达到80000个/ml即停止培养，时间18天，采用过滤收集金线莲细胞，将收集到的金线莲细胞杀青后70℃干燥至恒重，并磨成粉末，常温封闭保存备用；

提取阶段

1）醇沉

称取过20目筛的干燥的金线莲粉末50g加入4倍质量的体积分数为75%乙醇水溶液冷浸搅拌提取48小时，再利用45微米微孔滤膜对所得金线莲浸提液进行抽滤，对滤液进行8000rpm高速离心30分钟，获得上清液和沉淀；

2）去杂

将所述沉淀中加入3倍量蒸馏水溶解，于100℃煮沸10分钟，冷却后8000rpm高速离心30分钟，获得上清液和沉淀；进一步对上清液进行旋转蒸发浓缩，再干燥至恒重，获得可溶性金线莲多糖粉。