[发明专利]一种从真姬菇栽培废料中提取纤维素酶的方法

说明书

技术领域

 本发明属于真菌栽培废料生产技术领域，具体涉及一种从真姬菇栽培废料中提取纤维素酶的方法。

背景技术

真菌类的纤维素酶系，主要包括有外切β-1,4-葡聚糖酶、内切β-1,4-葡聚糖酶β-葡聚糖苷酶，其中以CMC酶代表的内切β-1,4-葡萄糖酶最为常见。真姬菇栽培废料中富含有纤维素酶等多种胞外酶，而真姬菇是目前工厂化生产主要品种之一，废菌袋来源稳定，为工厂化提取纤维素酶提供了稳定原料来源，在市场上有着巨大的应用前景。

纤维素酶是重要的水解纤维素类、半纤维素类物质的酶，在食品、造纸、饲料等许多工业领域上有非常广泛地应用价值。我国的食用菌栽培废料数量巨大，长期以来因为没有得到有效的利用，对环境和有机资源造成了恶劣的影响和巨大的浪费。据研究表明，食用菌栽培废料中含有大量残余的胞外酶，这些残留的胞外酶在造纸业、饲料业等工业上有非常广阔的利用价值和应用前景，利用食用菌采收后的废菌袋提取纤维素酶，在工艺上可节省微生物培养工序，节省酶制剂厂的办厂投入，降低生产成本，拓宽食用菌产业链的延伸，提高生产附加值，变废为宝。如何科学有效地开发利用这些资源，对于解决我国的能源短缺和环境污染及食用菌可持续发展等问题都具有极为重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从真姬菇栽培废料中提取纤维素酶的方法，我国的食用菌栽培废料数量巨大，长期以来因为没有得到有效的利用，对环境和有机资源造成了恶劣的影响和巨大的浪费。对于解决我国的能源短缺和环境污染及食用菌可持续发展等问题都具有极为重要的意义。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种从真姬菇栽培废料中提取纤维素酶的方法，所述方法包括：通过硫酸铵沉淀、透析、凝胶层析和离子交换层析对纤维素酶进行分离纯化，SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，最终获得纤维素酶。

所述方法具体包括如下：

（1）粗酶液的制备：真姬菇栽培废料粉碎混匀，按1:3加入缓冲液，混匀，室温静置3h；纱布过滤，4℃下10000r/min离心20min，取上清即为粗酶液；

（2）硫酸铵沉淀：取粗酶液10mL，20wt.%硫酸铵进行一次硫酸铵沉淀，80wt.%硫酸铵进行二次硫酸铵沉淀，4℃盐析10-15h，4℃，10000r/min离心20min，分别收集上清和沉淀，沉淀用缓冲液溶解至原体积，540nm波长处测定酶活；

（3）透析：粗酶液经硫酸铵沉淀后，10ml缓冲液至完全溶解，在同样的缓冲液，4℃，磁力搅拌器上透析；每隔2h更换一次透析液，直至向透析液中加入0.1mol/L BaCl₂溶液，检测无白色沉淀产生为止；收集酶液，4℃，10000r/min离心20min，取上清；冷冻干燥，少量缓冲液将可溶蛋白溶解，4℃，10000r/min离心20min，取上清；

（4）凝胶层析：缓冲液平衡Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析，流速为1.5mL/min，直至记录仪上的基准线值恒定，停止平衡；取2ml的透析纯化后酶液上柱，用缓冲液洗脱，收集各洗脱峰，检测各管酶活，合并有酶活管，冷冻浓缩；

（5）离子交换层析：用Tris-HCl缓冲液平衡DEAE C-52，取2ml 用Tris-HCl平衡缓冲液溶解的经Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析后的酶液上柱，采用含有NaCl浓度分别为0M、0.1M和1M的平衡缓冲液进行盐离子梯度洗脱，收集各洗脱峰；检测各洗脱峰的酶活，收集，冷冻干燥；

（6）酶纯度的鉴定：分离胶的浓度采用浓度为12%的聚丙烯酰胺，pH8.8Tris-HCl缓冲液，用考马斯亮蓝R-250进行染色。

步骤（1）-（4）中的缓冲液为0.02M pH4.8乙酸-乙酸钠缓冲液；步骤（5）所述的Tris-HCl缓冲液为0.02M pH7.0 Tris-HCl平衡缓冲液。

本发明的优点在于：

（1）真姬菇栽培废料中纤维素酶的最佳条件为：pH4.8，0.02 M pH4.8乙酸-乙酸钠缓冲液，浸提温度25℃、浸提时间为3h、料液比为1g/3mL。真姬菇栽培废料中纤维素酶浸提液最终酶活达到107.36U，酶活有了显著的提高，达到了优化的效果。

（2）真姬菇栽培废料酶液经硫酸铵盐析、透析除盐、冷冻干燥、Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析、透析除盐、冷冻干燥、DEAE C-52离子交换层析等分离纯化后，SDS-PAGE鉴定已达到电泳纯。纯化后的纤维素酶比活达到1121.82U/mg，纯化倍数为12.13，回收率为2.64%。