[发明专利]一种从真姬菇栽培废料中提取纤维素酶的方法

权利要求书

1.一种从真姬菇栽培废料中提取纤维素酶的方法，其特征在于：所述方法包括：通过硫酸铵沉淀、透析、凝胶层析和离子交换层析对纤维素酶进行分离纯化，SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，最终获得纤维素酶。

2.根据从权利要求1所述的一种从真姬菇栽培废料中提取纤维素酶的方法，其特征在于：所述方法具体包括如下：

（1）粗酶液的制备：真姬菇栽培废料粉碎混匀，按1:3加入缓冲液，混匀，室温静置3h；纱布过滤，4℃下10000r/min离心20min，取上清即为粗酶液；

（2）硫酸铵沉淀：取粗酶液10mL，20wt.%硫酸铵进行一次硫酸铵沉淀，80wt.%硫酸铵进行二次硫酸铵沉淀，4℃盐析10-15h，4℃，10000r/min离心20min，分别收集上清和沉淀，沉淀用缓冲液溶解至原体积，540nm波长处测定酶活；

（3）透析：粗酶液经硫酸铵沉淀后，10ml缓冲液至完全溶解，在同样的缓冲液，4℃，磁力搅拌器上透析；每隔2h更换一次透析液，直至向透析液中加入0.1mol/L BaCl₂溶液，检测无白色沉淀产生为止；收集酶液，4℃，10000r/min离心20min，取上清；冷冻干燥，少量缓冲液将可溶蛋白溶解，4℃，10000r/min离心20min，取上清；

（4）凝胶层析：缓冲液平衡Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析，流速为1.5mL/min，直至记录仪上的基准线值恒定，停止平衡；取2ml的透析纯化后酶液上柱，用缓冲液洗脱，收集各洗脱峰，检测各管酶活，合并有酶活管，冷冻浓缩；

（5）离子交换层析：用Tris-HCl缓冲液平衡DEAE C-52，取2ml 用Tris-HCl平衡缓冲液溶解的经Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析后的酶液上柱，采用含有NaCl浓度分别为0M、0.1M和1M的平衡缓冲液进行盐离子梯度洗脱，收集各洗脱峰；检测各洗脱峰的酶活，收集，冷冻干燥；

（6）酶纯度的鉴定：分离胶的浓度采用浓度为12%的聚丙烯酰胺，pH8.8Tris-HCl缓冲液，用考马斯亮蓝R-250进行染色。

3.根据从权利要求1所述的一种从真姬菇栽培废料中提取纤维素酶的方法，其特征在于：步骤（1）-（4）中的缓冲液为0.02M pH4.8乙酸-乙酸钠缓冲液；步骤（5）所述的Tris-HCl缓冲液为0.02M pH7.0 Tris-HCl平衡缓冲液。