[发明专利]基于金黄色葡萄球菌的生物探针、制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物病原检测技术领域，具体而言，涉及一种基于金黄色葡萄球菌的生物探针、制备方法及其应用。

背景技术

典型的金葡菌(金黄色葡萄球菌)为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。金葡菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococal Protein A，SPA)，或简称表面A蛋白,占整个细胞壁蛋白成分的6.7％，通过胞壁肽聚糖以共价键与之结合。

多数表面A蛋白呈一侧面稍凹的椭球形结构，结构稳定、均一，长约为40.88±1.58nm，宽约为20.82±0.68nm，高约为10.51±0.28nm。

表面A蛋白由亮、缬、脯、丙、苏、甘、丝、谷丙、天门冬及赖氨酸等十种氨基酸组成。由于其不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以无二硫键。紫外光谱和吸收系数为A275nm％＝1.65，等电点为pH5.1。表面A蛋白十分稳定，用4mol/L尿素、硫氰盐酸、6mol/L的盐酸胍和pH2.5的酸性条件，以及加热煮沸均不影响其活性。

表面A蛋白能与人及多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合，结合的亲和性次序依次是猪、狗、兔、人、猴、鼠、小鼠及牛；对大白鼠、绵羊的亲和力差；对马、犊牛、山羊等无亲和力；对所有的鱼类、两栖类、爬行类、鸟类(除少数例外)均不能与之结合。基于金黄色葡萄球菌A蛋白的免疫学性质，预示着其可以作为载体并与已知的标准血清进行修饰吸附，进而获得吸附有抗体的载体，通过进行协同凝集反应并应用到检测相应的未知抗原中。虽然，上述的方式其检测未知抗原的特异性和敏感性均较好，但是，相关技术中，由于对金黄色葡萄球菌没有进行特定的处理，因此，在鉴定其协同凝集后的凝集产物时，其分辨率差(常需要借助大型的仪器进行分析辨别)，因此，不易判定其凝集结果，进而严重影响了其在免疫学检测中的应用。

综上，提供一种便于观测凝集结果的金黄色葡萄球菌的生物探针并应用到抗原检测中是本领域亟待解决的一个技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于金黄色葡萄球菌的生物探针；以解决上述的问题。本发明的另外一个目的在于提供一种上述生物探针的制备方法，并实现其应用。

在本发明的实施例中提供了一种基于金黄色葡萄球菌的生物探针，包括：金葡菌载体以及标记在所述金葡菌载体的表面A蛋白上，且能够与被检测抗原特异性结合的抗体；其中，所述金葡菌载体被四唑氯化物染料染至红色。

本发明提供的这种基于金黄色葡萄球菌的生物探针，金黄色葡萄球菌作为基本的结构组成，由于其细胞壁上含有一定量结构稳定的表面A蛋白，而该表面A蛋白则可以和多种动物血清中的IgG分子中的Fc片段结合，即其表面A蛋白可以和标记有被检测抗原特异性结合的抗体，通过抗体与未知抗原的特异性结合以及发生的协同凝集反应进而实现抗原的检测。更为重要的，由于金葡菌载体是被四唑氯化物染料染至红色的，具体的，四唑氯化物染料可被金葡菌内部所含的各类氧化还原酶作用，生成红色的不溶物(在细菌内部发生)，进而使得整个金葡菌显现出红色，即得到红色的金葡菌载体。因此，该红色的载体与相应的抗体标记之后(生物探针)，其与特定的抗原发生协同凝集反应时，生物探针兼具乳胶微球和红细胞优点，颗粒均一、稳定，与抗原结合能力以及凝集性能强，颜色鲜明，使得凝集结果非常易于判定。与现有技术相比，该体系的凝集反应的分辨率、灵敏度和特异性都得到了很大的提高，因此，可有效地应用到免疫学检测中。

可选的，四唑氯化物染料具体为5-氰基-2，3-二(4-甲基苯基)四唑氯化物。

一种上述的生物探针的制备方法，包括以下步骤：

1)、利用LB平板划线分离出金葡菌，再利用LB液体培养基进行扩大培养，得到OD600为0.5-1.5的金葡菌悬液；

2)、在所述金葡菌悬液中加入四唑氯化物染料，并使得所述四唑氯化物染料的终浓度达到1-10mM，染色10-30min，得到红色菌悬液；

3)、将所述红色菌悬液依次进行离心收集菌体、缓冲液清洗、重悬以及灭活，得到红色的金葡菌载体悬液；

4)、将红色的所述金葡菌载体悬液与能够和被检测的抗原特异性结合的抗体混合后依次进行孵育、离心收集沉淀、缓冲液清洗以及重悬，得到标记有抗体的菌悬液；

5)、将所述标记有抗体的菌悬液中加入封闭剂后颠倒混匀，进行封闭处理，得到红色的生物探针。

可选的，在步骤4)中，所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体；在步骤5)中，所述封闭剂包括脱脂奶粉或牛血清蛋白。