[发明专利]一种基于轴向超高速扫描的三轴数字扫描光片显微镜

说明书

本发明提供一种基于轴向超高速扫描的三轴数字扫描光片显微镜，主要涉及荧光显微镜领域。通过在激发光路中设置光束光路快速变焦装置，用于快速调制光的焦点位置；和快速光强调制装置，用于快速调制光强；发明了一种在不改变光片厚度的条件下，可以增加并且调节扫描范围的光片显微镜。这项新技术能够提供亚微米级的z轴分辨率，在深层组织中(大于500μm)170×170μm²大小的视野以及高达1毫秒的时间分辨率。2P3A‑DSLM解决了小型模式生物体的亚细胞结构以及活体动态过程的长时间成像问题。

技术领域

本发明涉及一种基于轴向超高速扫描的三轴数字扫描光片显微镜，主要涉及荧光显微镜技术领域。

背景技术

背景技术：

最近出现的光片荧光显微镜技术(light-sheet fluorescent microscopy，LSFM)已经给生物三维成像技术带来了革命性变化。LSFM具有高时间分辨率以及很小的光损伤等特点，使得通过荧光成像对小型模式生物或组织的长时间观察成为可能。

光片显微镜使用一层光束从样品侧面激发荧光样品，通过照相设备检测成像，其入射照明光路和照相设备接收荧光光路互相垂直。传统光片显微镜分类：从激光光源讲：分为连续光光片显微镜和双光子光片显微镜。前者的好处是造价低，结构简单。缺点是：穿透能力很弱，不适合深层组织成像。后者的好处是成像深度深，可以做活体组织成像。从系统构架来讲：分为水平构架，垂直构架和倒置构架三种。水平构架中，光片照明的物镜和信号接收的物镜都是水平放置，即整个光路平面与水平面垂直，而样本固定在一个琼脂糖柱里竖直放置。这种构架的好处是，系统稳定，样本可以360度自由移动。缺点是样本制备相对繁琐。垂直构架中，接收信号的物镜垂直放置，与普通的正置显微镜相同。而激发光片的物镜水平放置，使得产生的光片与水平面平行。优点是可以与现有的传统正置显微镜兼容。缺点是激发光物镜的光片厚度较厚，无法进行亚细胞结构观察。倒置构架中，激发物镜和发射物镜成垂直的V字形倒置在样本之上，形成的光片和成像面都与水平面成45度并互相垂直。该构架的好处是可以与传统的样本制备标准兼用。劣势是结构不够稳定，并且样本不能随意转动。从光片形成方式来讲，分为柱面镜式和扫描式。柱面镜式是通过一个柱面镜让一束激光在一个方向上聚焦，而另一个方向上保持准直而形成光片。这种方法的好处是结构简单，劣势是单位面积下的光功率较低，不适合做多光子扫描显微镜。扫描式是通过扫描器件，将一束准直的高斯光束在y轴方向上快速扫描，进而在照相机一次曝光时间内形成均匀的片状光。优点是单位时间内的光功率强，可以做双光子成像。缺点是结构相对复杂。

Truong等人通过将双光子技术和光片显微镜结合起来实现了双光子数字扫描光片显微镜(2P-DSLM)，该系统能够在高散射的果蝇胚胎或者快速跳动的斑马鱼心脏中进行深层组织成像[1]。与经典的光片荧光显微镜结构相似，双光子数字扫描光片显微镜使用一个低数值孔径的物镜(NA＜0.1)来实现长时间均匀照明，然而这导致产生的光片过厚，从而降低轴向分辨率和图像的对比度。另一方面，Betzig和他的同事利用贝塞尔光束来产生一个纤薄的单光子光片，得到了相当不错的轴向分辨率[2]。然而，这样的系统中，视野和穿透深度是非常有限的。常规的LSFM显微镜或者双光子数字扫描光片显微镜还有一个非常显著的问题，就是在工作的时候，其光片的厚度主要是由扫描的数值孔径NA决定，当增加扫描范围的时候，必然会增加光片厚度。目前有关于光片显微镜的专利文献比如CN102455501A，其利用机械移动的透镜组进行光学变焦，变焦频率十分低，导致不能实现快速拍照，限制了其实际产业方面应用范围；并且其只能通过改变数值孔径来改变照射区域的大小。在其增加扫描范围的时候，也不能避免光片厚度的增加。

引用文献：

1.Truong TV，Supatto W，Koos DS，Choi JM，Fraser SE.Nat Methods2011；8：757-760.

2.Gao L，Shao L，Higgins CD et al.Cell 2012；151：1370-1385.