[发明专利]一种电化学膀胱癌DNA传感器的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及膀胱癌DNA检测技术，具体为一种电化学膀胱癌DNA传感器的制备方法。该传感器将核酸杂交技术与电化学技术有机结合，通过循环伏安(CV)和差分脉冲(DPV)法的峰信号来检测膀胱癌的特异DNA。

背景技术

脱氧核糖核酸(DNA)对于所有生命体来说是一种最重要的基础生物分子。因此，对于DNA序列的识别和定量分析在基因诊断，疾病预防以及微生物检测领域有着非常重要的意义。近年来，随着生物技术的飞速发展和电子信息技术的长足进步，DNA序列检测技术也突飞猛进，检测方法的研究也取得了重大进展。如荧光检测法，荧光耦合聚合酶链反应法(PCR)，化学发光检测法，光密度成像检测法等这些DNA检测方法已经被应用于DNA的科学研究和临床检测。但是，上述检测方法在检测过程中，操作难度大，技术较为复杂，所需专业仪器昂贵，这些因素都使得DNA检测技术的发展收到了很大程度的制约。所以，新型电化学DNA传感器的开发与应用有着极其重要的意义。

目前，传统的DNA分子检测方法主要有荧光法(Audrey et al.Chem.Rev.，2008，109-139)，这种方法通过荧光共振转移原理(FRET)使发光体在遇到目标DNA后其荧光强度产生变化，通过对荧光信号的表征分析对目标DNA进行检测。但是，该方法前期样品制备复杂，实验误差较大，实验周期长，所需仪器昂贵，不利于快速、准确、方便地检测DNA序列。另外一种常用的DNA分子检测方法是压电晶体传感器法。这种传感器的构建依据是通过DNA杂交前后的质量变化，对DNA分子进行检测。该方法操作相对简单，但实验中所需要的石英晶体声微天平价格昂贵，并且检测的精度并不是很高。

电化学检测法是近年来新发展的一种高效并且准确可靠的分析检测方法，该方法在分析检测领域已经收到了人们广泛的关注和研究。因此，利用电化学法构建电化学DNA生物传感器并应用于DNA序列的检测也逐渐成为了一项新的DNA检测技术。目前，电化学DNA生物传感器的种类主要有发卡探针型传感器(Jin et al.，Biosens.Bioelectron..2007，1126-1130)，适体型传感器(Yan et al.，Sens.Actuat.B-Chem..2011，1380-1385)，以及层层自组装型传感器(Pandey et al.，Sens.Actuat.B-Chem..2011，333-340)。相对于传统的DNA检测方法，电化学DNA检测法具有选择性高、灵敏度好、稳定性强、检测成本低廉、能在复杂的体系中快速检测等特点。因此，新型电化学DNA传感器的创新开发具有非常重要的实际意义。

膀胱癌是目前世界上最常见的癌症之一，世界上患有膀胱癌疾病的患者多达2700万人(Kim et al.，Biosens.Bioelectron..2013，152-157)。由于膀胱癌的高复发率和癌细胞扩散的高速率(Du et al.，J.Photochem.Photobiol.B.2014，1-10)，所以膀胱癌的早期预防和诊断就显得非常重要。目前，对于膀胱癌的临床检测手段主要是通过常规的医学仪器(如CT，B超等)进行检查和确诊。这种传统的检查方法通常需要3至5天才可得到检查结果，并且需要医师反复查看才能最终确诊。相比于这种方法，电化学检测法可以实现高效，准确并且方便地对膀胱癌细胞进行体外检测。

发明内容

针对传统DNA检测技术的不足，本发明要解决的主要技术问题是，开发一种新型的电化学膀胱癌DNA传感器。该传感器具有很好的灵敏性，选择性和稳定性，适用于DNA分析技术。其检测效率，检测灵敏度以及目标DNA选择性均优于传统DNA检测方法，且制备工艺简单，成本低廉，适用性好，便于实际推广应用。

本发明解决所述电化学膀胱癌DNA传感器的技术方案是，通过电化学蚀刻方法将玻碳电极(GCE)表面羧基化，再将氨基标记的膀胱癌细胞特异DNA探针组装到玻碳电极上，制备膀胱癌DNA生物传感器。以玻碳电极为基底电极，依次进行电极羧基化和探针单链DNA(ssDNA)的组装，其中玻碳电极羧基化是为了固定探针ssDNA，探针ssDNA是识别元件，生物连接剂是1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。其特征在于，获得高灵敏度的电化学膀胱癌DNA传感器。这种传感器检测效率高，灵敏度好，稳定性强，选择性好，其检测结果明显优于传统DNA检测方法。