[发明专利]一种基于酸中心复合物的免疫传感器的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种酸中心复合物电化学免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用FA@PANI@CS-HCl制备一种检测肿瘤标志物的电化学免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。

背景技术

癌症是一大类恶性肿瘤的统称。肿瘤在发生发展过程中，肿瘤细胞异常表达或宿主细胞对肿瘤反应后产生的某些物质,如肿瘤特异性抗原、胚胎抗原、某些分化抗原、激素和同工酶等,可作为肿瘤标志物，用于临床某些肿瘤的诊断和辅助诊断。因此，在临床研究上，发展一种快速、简便、灵敏的检测肿瘤标志物方法是十分重要的。

电化学免疫传感器具有灵敏度高、选择性好、结构简单、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等优点，因此本发明制备了一种合金负载分子筛电化学免疫传感器，实现了对肿瘤标志物的检测。

目前已有的肿瘤标志物的临床检测方法很多,如放射免疫分析、化学发光免疫分析、酶联免疫分析等。免疫传感器是将免疫学方法与分析化学方法相结合的一种生物传感器，通过抗原与抗体之间的特性性结合，使得它具有高灵敏性、高选择性、分析快速和操作简便等优点。

    本发明采用FA@PANI@CS-HCl为基底材料，FA产生电化学信号，PANI提高电极表面的导电性和比表面积，从而利用CS-HCl良好的成膜性，实现了基底材料FA@PANI@CS-HCl对电极的良好修饰，实现了其对免疫分子的成功固定，增强了传感器的灵敏度，扩宽了线性范围，有效地降低了传感器的检出限，并可用于多种肿瘤标志物的分析。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，有效克服了目前肿瘤标志物检测方法的不足。

发明内容

本发明的目的之一是基于酸中心复合物FA@PANI@CS-HCl为基底材料，构建了一种无酶，无标记的快速超灵敏的电化学免疫传感器。

本发明的目的之二就是将Ag@Co₃O₄用于孵化抗体，实现了对肿瘤标志物的高灵敏检测。

本发明的目的之三就是将该无标记电化学免疫传感器用于多种肿瘤标志物的检测。

本发明的技术方案如下：

1.一种基于酸中心复合物的免疫传感器的制备方法

（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；将6 μL、0.5 ~ 2 mg/mL 酸中心复合物FA@PANI@CS-HCl分散液滴加到电极表面，室温下晾干成膜； 

（2）依次滴加6 μL的EDC/NHS溶液、6 μL的Ab-Ag@Co₃O₄抗体孵化物溶液于电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；所述EDC/NHS溶液是由0.1 mol/L 的EDC和0.1 mol/L 的NHS按照1 ~ 4 : 1的体积比混合制得；

（3）滴加6 μL、质量分数为0.5% ~ 2%的BSA溶液于电极表面，封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；

（4）滴加6 μL、0.0001~2 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液至电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干，制得一种基于酸中心复合物的免疫传感器。

2. 酸中心复合物FA@PANI@CS-HCl分散液的制备

将0.4~2.0 mg的二茂铁甲酸FA与0.4~2.0 mg的盐酸掺杂的聚苯胺PANI混合，分散于1 mL、0.5~10 mg/mL的壳聚糖盐酸盐CS-HCl水溶液中，震荡超声24 h，混合均匀。

3. Ab-Ag@Co₃O₄抗体孵化物溶液的制备 

（1）Co₃O₄纳米片的制备

在磁力搅拌下，将2.0~3.0 g的CoCl₂·6H₂O溶于50~70 mL 超纯水中，制得CoCl₂水溶液；将20 mL、0.1~1.0 mol/L NaOH水溶液逐滴加入到CoCl₂水溶液中，继续搅拌5 min，得到棕色沉淀，离心，用超纯水和无水乙醇分别洗涤3次，在60 ℃真空干燥箱中干燥12 h，制得固体沉淀物，将其在300~500℃下煅烧1 h，逐渐降到室温，制得Co₃O₄纳米片；