[发明专利]一种高活性纤维二糖酶及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种在较高温度下可高效分解纤维二糖的纤维二糖酶，以及该纤维二糖酶的编码基因与应用。 

背景技术

纤维二糖酶(EC 3.2.1.21，也称β-葡萄糖苷酶β-glucosidase)属于外切水解酶类。它的特性是可水解结合于末端、非还原性的β-D-糖苷键，同时释放β-D-葡萄糖和相应的配基；此外还能微弱地水解对硝基苯-β-D-半乳糖和β-D-木糖苷。纤维二糖酶不仅是纤维素酶重要组成成分，降解纤维素的关键酶而且常被用作风味酶，提高啤酒、果汁等的风味。 

目前，寻找具有耐高糖的纤维二糖酶成为研究纤维二糖酶的热点，因为这种酶可以提高木质纤维素的糖化速率。报道显示有些微生物纤维二糖酶有较高的葡萄糖抑制常数，糖耐受性高(Lu,J.,et al.,Expression and characterization of a novel highly glucose-tolerant beta-glucosidase from a soil metagenome.Acta Biochimica Et Biophysica Sinica,2013.45(8):p.664-673.)，但是这些酶对纤维二糖的水解活性相当低。纤维二糖是纤维素分子的结构单元，也是纤维素酶水解纤维素时的主要产物，它能强烈抑制纤维素酶的水解作用。纤维二糖酶能够水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖，是纤维素酶的限速酶。它不仅可水解纤维二糖，更可解除纤维二糖对内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的抑制，提高水解速率和程度(Gusakov,A.V.,et al.,Design of highly efficient cellulase mixtures for enzymatic hydrolysis of cellulose.Biotechnology and Bioengineering,2007.97(5):p.1028-1038.)。人们发现，水解纤维素过程中，由于纤维二糖酶活力的匮乏，反应体系中常常出现纤维二糖的累积，而纤维 二糖的累积对内切型-β-葡聚糖酶及外切型-β-葡聚糖酶的水解反应具有很强的反馈抑制作用(Shen,Y.,et al.,Simultaneous saccharification and fermentation of acid-pretreated corncobs with a recombinant Saccharomyces cerevisiae expressing beta-glucosidase.Bioresource Technology,2008.99(11):p.5099-5103.)。因此获得能耐受很高的葡萄糖浓度且具有很强分解纤维二糖的活性的纤维二糖酶对降解廉价纤维素生物质，解决能源危机具有重要的现实意义。 

工业应用过程中，酶热稳定性越高越有利，所以采用基因工程手段从嗜热菌中克隆表达纤维二糖酶引起了人们的兴趣。大肠杆菌由于系统简单，在表达系统的选择上范围广泛，因此通常被用作蛋白质表达的宿主菌。已有报道来源于嗜热菌和真菌的一些基因在E.coli中大量表达时，常常出现表达的蛋白质形成包涵体或被蛋白酶降解的情况，原因可能重组蛋白不能正确折叠(Pan,K.L.,et al.,Roles of DegP in prevention of protein misfolding in the Periplasm upon overexpression of penicillin acylase in Escherichia coli.Journal of Bacteriology,2003.185(10):p.3020-3030.)。已证实，分子伴侣可以参与蛋白质的正确折叠。据报道，目的蛋白质与伴侣蛋白共同表达，便可增加可溶性蛋白质的回收率，而使用通常方法，由于包涵体的形成，这些表达蛋白质常常是不可回收的(de Marco,A.,et al.,Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E-coli.Bmc Biotechnology,2007.7.)。 

发明内容

本发明的目的是提供一种具有较高产物葡萄糖耐受的高活性纤维二糖酶及其编码基因与应用。 

本发明所提供的高活性纤维二糖酶，来源于嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium aotearoense SCUT27)，是如下(a)或(b)的蛋白质：